За ефективноконтрол на комаритеи за да се намали честотата на болестите, които те пренасят, са необходими стратегически, устойчиви и екологично чисти алтернативи на химичните пестициди. Оценихме семенни шротове от някои Brassicaceae (семейство Brassica) като източник на растителни изотиоцианати, получени чрез ензимна хидролиза на биологично неактивни глюкозинолати, за употреба в контрола на египетския Aedes (L., 1762). Петкратно обезмаслено семенно шрот (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 и Thlaspi arvense – три основни вида термична инактивация и ензимно разграждане. Химични продукти: За да се определи токсичността (LC50) на алил изотиоцианат, бензил изотиоцианат и 4-хидроксибензилизотиоцианат за ларвите на Aedes aegypti при 24-часова експозиция = 0,04 g/120 ml dH2O). Стойностите на LC50 за брашното от семена на синап, бял синап и хвощ са съответно 0,05, 0,08 и 0,05 в сравнение с алил изотиоцианат (LC50 = 19,35 ppm) и 4,2-хидроксибензилизотиоцианат (LC50 = 55,41 ppm) е по-токсичен за ларвите 24 часа след третирането, отколкото съответно 0,1 g/120 ml dH2O. Тези резултати са в съответствие с производството на брашно от семена на люцерна. По-високата ефективност на бензиловите естери съответства на изчислените стойности на LC50. Използването на брашно от семена може да осигури ефективен метод за борба с комарите. Това показва ефективността на праха от семена на кръстоцветни и неговите основни химични компоненти срещу ларвите на комарите и показва как естествените съединения в праха от семена на кръстоцветни могат да служат като обещаващ екологично чист ларвицид за борба с комарите.
Векторните заболявания, причинени от комари Aedes, остават основен световен проблем за общественото здраве. Честотата на заболяванията, пренасяни от комари, се разпространява географски1,2,3 и се появява отново, което води до огнища на тежки заболявания4,5,6,7. Разпространението на болести сред хора и животни (напр. чикунгуня, денга, треска от долината Рифт, жълта треска и вирус Зика) е безпрецедентно. Само денга излага на риск от инфекция приблизително 3,6 милиарда души в тропиците, като се оценява, че годишно се случват 390 милиона инфекции, което води до 6 100–24 300 смъртни случая годишно8. Повторната поява и огнището на вируса Зика в Южна Америка привлече вниманието на целия свят поради мозъчните увреждания, които причинява при деца, родени от заразени жени2. Кремер и др.3 прогнозират, че географският обхват на комарите Aedes ще продължи да се разширява и че до 2050 г. половината от населението на света ще бъде изложено на риск от инфекция с арбовируси, пренасяни от комари.
С изключение на наскоро разработените ваксини срещу денга и жълта треска, ваксини срещу повечето заболявания, пренасяни от комари, все още не са разработени9,10,11. Ваксините все още се предлагат в ограничени количества и се използват само в клинични изпитвания. Контролът на комарите-преносчици с помощта на синтетични инсектициди е ключова стратегия за контрол на разпространението на болести, пренасяни от комари12,13. Въпреки че синтетичните пестициди са ефективни при убиването на комари, продължаващата употреба на синтетични пестициди влияе негативно върху нецелевите организми и замърсява околната среда14,15,16. Още по-тревожна е тенденцията за увеличаване на резистентността на комарите към химически инсектициди17,18,19. Тези проблеми, свързани с пестицидите, ускориха търсенето на ефективни и екологични алтернативи за контрол на преносителите на болести.
Различни растения са разработени като източници на фитопестициди за борба с вредителите20,21. Растителните вещества обикновено са екологични, тъй като са биоразградими и имат ниска или незначителна токсичност за нецелевите организми като бозайници, риби и земноводни20,22. Известно е, че билковите препарати произвеждат разнообразни биоактивни съединения с различни механизми на действие за ефективен контрол на различните жизнени етапи на комарите23,24,25,26. Съединения, получени от растения, като етерични масла и други активни растителни съставки, са привлекли вниманието и са проправили пътя за иновативни инструменти за контрол на векторите на комари. Етеричните масла, монотерпените и сескитерпените действат като репеленти, средства за предотвратяване на храненето и овициди27,28,29,30,31,32,33. Много растителни масла причиняват смъртта на ларвите, какавидите и възрастните комари34,35,36, засягайки нервната, дихателната, ендокринната и други важни системи на насекомите37.
Последните проучвания дадоха представа за потенциалната употреба на синапените растения и техните семена като източник на биоактивни съединения. Шротът от синапено семе е тестван като биофумигант38,39,40,41 и се използва като почвен препарат за потискане на плевелите42,43,44 и контрол на почвени растителни патогени45,46,47,48,49,50, подхранване на растенията, нематоди41,51, 52, 53, 54 и вредители55, 56, 57, 58, 59, 60. Фунгицидната активност на тези прахове от семена се дължи на растителни защитни съединения, наречени изотиоцианати38,42,60. В растенията тези защитни съединения се съхраняват в растителните клетки под формата на небиоактивни глюкозинолати. Когато обаче растенията са увредени от хранене с насекоми или патогенна инфекция, глюкозинолатите се хидролизират от мирозиназа до биоактивни изотиоцианати55,61. Изотиоцианатите са летливи съединения, за които е известно, че имат широкоспектърна антимикробна и инсектицидна активност, а тяхната структура, биологична активност и съдържание варират значително между видовете Brassicaceae42,59,62,63.
Въпреки че е известно, че изотиоцианатите, получени от брашно от синапено семе, имат инсектицидна активност, липсват данни за биологичната активност срещу медицински важни членестоноги вектори. Нашето проучване изследва ларвицидната активност на четири обезмаслени праха от семена срещу комари Aedes. Ларви на Aedes aegypti. Целта на проучването беше да се оцени потенциалната им употреба като екологично чисти биопестициди за борба с комарите. Три основни химични компонента на брашното от семена, алил изотиоцианат (AITC), бензил изотиоцианат (BITC) и 4-хидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC), също бяха тествани, за да се тества биологичната активност на тези химични компоненти върху ларвите на комарите. Това е първият доклад, който оценява ефективността на четири праха от зелеви семена и техните основни химични компоненти срещу ларвите на комарите.
Лабораторните колонии от Aedes aegypti (щам Rockefeller) бяха поддържани при 26°C, 70% относителна влажност (RH) и 10:14 часа (L:D фотопериод). Чифтосаните женски бяха настанени в пластмасови клетки (височина 11 см и диаметър 9,5 см) и хранени чрез система за хранене с шише, използваща цитратна говежда кръв (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). Храненето с кръв се извършваше както обикновено, като се използваше мембранна многостъклена хранилка (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA), свързана с циркулираща водна баня (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) с контрол на температурата 37°C. Разтегнете филм от Parafilm M върху дъното на всяка стъклена хранителна камера (площ 154 mm2). Всяка хранилка след това беше поставена върху горната решетка, покриваща клетката, съдържаща чифтосаната женска. Приблизително 350–400 μl говежда кръв бяха добавени към стъклена фуния за подаване с помощта на пипета на Пастьор (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ) и възрастните червеи бяха оставени да се отцедят поне един час. След това на бременните женски беше даден 10% разтвор на захароза и им беше позволено да снесат яйца върху влажна филтърна хартия, поставена в отделни ултрапрозрачни чашки за суфле (размер 1,25 течни унции, Dart Container Corp., Mason, MI, САЩ). Филтърната хартия, съдържаща яйцата, се поставя в запечатана торбичка (SC Johnsons, Racine, WI) и се съхранява при 26°C. Яйцата бяха излюпени и приблизително 200–250 ларви бяха отгледани в пластмасови тави, съдържащи смес от храна за заеци (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, САЩ) и черен дроб на прах (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, САЩ) и рибно филе (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Германия) в съотношение 2:1:1. В нашите биологични анализи бяха използвани ларви от късен трети стадий.
Използваният в това проучване растителен семенен материал е получен от следните търговски и правителствени източници: Brassica juncea (кафяв синап - Pacific Gold) и Brassica juncea (бял синап - Ida Gold) от Pacific Northwest Farmers' Cooperative, щата Вашингтон, САЩ; (градински кресон) от Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, САЩ и Thlaspi arvense (полски пеникрес - Elisabeth) от USDA-ARS, Peoria, IL, САЩ; Нито едно от семената, използвани в проучването, не е третирано с пестициди. Целият семенен материал е обработен и използван в това проучване в съответствие с местните и националните разпоредби и в съответствие с всички съответни местни, щатски и национални разпоредби. Това проучване не изследва трансгенни сортове растения.
Семената от Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), бял синап (IG) и Thlaspi arvense (DFP) бяха смлени на фин прах с помощта на ултрацентробежна мелница Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Германия), оборудвана с размер на отворите 0,75 mm и ротор от неръждаема стомана, 12 зъба, 10 000 оборота в минута (Таблица 1). Смленият прах от семена беше прехвърлен в хартиена напръстник и обезмаслен с хексан в апарат на Сокслет в продължение на 24 часа. Подпроба от обезмаслен полски синап беше обработена термично при 100 °C в продължение на 1 час, за да се денатурира мирозиназата и да се предотврати хидролизата на глюкозинолати, за да се образуват биологично активни изотиоцианати. Термично обработен прах от семена на хвощ (DFP-HT) беше използван като отрицателна контрола чрез денатуриране на мирозиназата.
Съдържанието на глюкозинолати в обезмасленото брашно от семена беше определено трикратно с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC) съгласно предварително публикуван протокол 64. Накратко, 3 mL метанол бяха добавени към 250 mg проба от обезмаслено семе на прах. Всяка проба беше обработена с ултразвук във водна баня в продължение на 30 минути и оставена на тъмно при 23°C в продължение на 16 часа. 1 mL аликвотна част от органичния слой след това беше филтрирана през 0,45 μm филтър в автосамплер. Работейки с Shimadzu HPLC система (две LC 20AD помпи; автосамплер SIL 20A; дегазатор DGU 20As; UV-VIS детектор SPD-20A за мониторинг при 237 nm; и комуникационен модул CBM-20A), съдържанието на глюкозинолати в брашното от семена беше определено трикратно с помощта на софтуера Shimadzu LC Solution версия 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Колоната беше C18 Inertsil колона с обратна фаза (250 mm × 4.6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Началните условия на мобилната фаза бяха зададени на 12% метанол/88% 0.01 M тетрабутиламониев хидроксид във вода (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) със скорост на потока 1 mL/min. След инжектиране на 15 μl от пробата, началните условия бяха поддържани в продължение на 20 минути, след което съотношението на разтворителя беше коригирано на 100% метанол, с общо време за анализ на пробата от 65 минути. Стандартна крива (базирана на nM/mAb) беше генерирана чрез серийни разреждания на прясно приготвени стандарти за синапин, глюкозинолат и мирозин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), за да се оцени съдържанието на сяра в обезмасленото брашно от семена. Концентрациите на глюкозинолати в пробите бяха тествани на Agilent 1100 HPLC (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ), използвайки OpenLAB CDS ChemStation версия (C.01.07 SR2 [255]), оборудвана със същата колона и използвайки предварително описан метод. Концентрациите на глюкозинолати бяха определени така, че да бъдат сравними между HPLC системите.
Алил изотиоцианат (94%, стабилен) и бензил изотиоцианат (98%) са закупени от Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ). 4-Хидроксибензилизотиоцианат е закупен от ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, САЩ). Когато се ензимно хидролизират от мирозиназа, глюкозинолатите, глюкозинолатите и глюкозинолатите образуват съответно алил изотиоцианат, бензил изотиоцианат и 4-хидроксибензилизотиоцианат.
Лабораторните биологични анализи бяха проведени съгласно метода на Muturi et al. 32 с модификации. В изследването бяха използвани пет нискомаслени семенни фуражи: DFP, DFP-HT, IG, PG и Ls. Двадесет ларви бяха поставени в 400 mL еднократна трипътна чаша (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA), съдържаща 120 mL дейонизирана вода (dH2O). Седем концентрации на семенно брашно бяха тествани за ларвна токсичност на комарите: 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 и 0.12 g семенно брашно/120 ml dH2O за DFP семенно брашно, DFP-HT, IG и PG. Предварителните биологични анализи показват, че обезмасленото семенно брашно Ls е по-токсично от четири други тествани семенни брашна. Следователно, коригирахме седемте концентрации на третиране на семенно брашно от Ls до следните концентрации: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 и 0,075 g/120 mL dH2O.
Нетретирана контролна група (dH20, без добавка на семенно брашно) беше включена, за да се оцени нормалната смъртност от насекоми при условия на анализа. Токсикологичните биологични анализи за всяко семенно брашно включваха три повторни чаши с три наклона (20 ларви от късен трети стадий на чаша), за общо 108 флакона. Третираните контейнери се съхраняваха при стайна температура (20-21°C) и смъртността на ларвите беше регистрирана в продължение на 24 и 72 часа непрекъснато излагане на третираните концентрации. Ако тялото и придатъците на комара не се движат при пробиване или докосване с тънка шпатула от неръждаема стомана, ларвите на комарите се считат за мъртви. Мъртвите ларви обикновено остават неподвижни в гръбно или вентрално положение на дъното на контейнера или на повърхността на водата. Експериментът беше повторен три пъти в различни дни, като се използваха различни групи ларви, за общо 180 ларви, изложени на всяка третирана концентрация.
Токсичността на AITC, BITC и 4-HBITC върху ларвите на комарите беше оценена, използвайки същата процедура за биологичен анализ, но с различни обработки. Пригответе 100 000 ppm основни разтвори за всеки химикал, като добавите 100 µL от химикала към 900 µL абсолютен етанол в 2-mL центрофужна епруветка и разклатете в продължение на 30 секунди, за да се смесят добре. Концентрациите за третиране бяха определени въз основа на нашите предварителни биологични анализи, които установиха, че BITC е много по-токсичен от AITC и 4-HBITC. За определяне на токсичността бяха използвани 5 концентрации на BITC (1, 3, 6, 9 и 12 ppm), 7 концентрации на AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm) и 6 концентрации на 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm, 30, 45, 60, 75 и 90 ppm). Контролната обработка беше инжектирана със 108 μL абсолютен етанол, което е еквивалентно на максималния обем на химическото третиране. Биологичните анализи бяха повторени както по-горе, като бяха експонирани общо 180 ларви на концентрация за третиране. Смъртността на ларвите беше регистрирана за всяка концентрация на AITC, BITC и 4-HBITC след 24 часа непрекъсната експозиция.
Пробит анализ на 65 данни за дозозависима смъртност беше извършен с помощта на софтуера Polo (Polo Plus, LeOra Software, версия 1.0), за да се изчислят 50% летална концентрация (LC50), 90% летална концентрация (LC90), наклон, коефициент на летална доза и 95% летална концентрация, базиран на доверителни интервали за съотношения на летални дози за логаритмично трансформирани криви на концентрация и доза-смъртност. Данните за смъртността се базират на комбинирани повторни данни от 180 ларви, изложени на всяка третирана концентрация. Вероятностните анализи бяха извършени отделно за всяко семенно брашно и всеки химичен компонент. Въз основа на 95% доверителен интервал на съотношението на леталната доза, токсичността на семенното брашно и химичните съставки за ларвите на комарите се счита за значително различна, така че доверителен интервал, съдържащ стойност 1, не е значително различен, P = 0,0566.
Резултатите от HPLC за определяне на основните глюкозинолати в обезмаслени брашна от семена DFP, IG, PG и Ls са изброени в Таблица 1. Основните глюкозинолати в тестваните брашна от семена варират с изключение на DFP и PG, които и двете съдържат мирозиназни глюкозинолати. Съдържанието на мирозинин в PG е по-високо, отколкото в DFP, съответно 33,3 ± 1,5 и 26,5 ± 0,9 mg/g. Прахът от семена Ls съдържа 36,6 ± 1,2 mg/g глюкогликон, докато прахът от семена IG съдържа 38,0 ± 0,5 mg/g синапин.
Ларвите на комарите от вида Ae. Aedes aegypti бяха унищожени при третиране с обезмаслено семенно брашно, въпреки че ефективността на третирането варираше в зависимост от вида растение. Само DFP-NT не беше токсичен за ларвите на комарите след 24 и 72 часа експозиция (Таблица 2). Токсичността на активния семенен прах се увеличаваше с увеличаване на концентрацията (Фиг. 1A, B). Токсичността на семенното брашно за ларвите на комарите варираше значително въз основа на 95% доверителен интервал (CI) на съотношението на леталната доза на LC50 стойностите при 24-часова и 72-часова оценка (Таблица 3). След 24 часа токсичният ефект на семенното брашно с Ls беше по-голям от други третирания със семенно брашно, с най-висока активност и максимална токсичност за ларвите (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Ларвите са по-малко чувствителни към DFP на 24 часа в сравнение с третиранията с IG, Ls и PG прах от семена, със стойности на LC50 съответно 0,115, 0,04 и 0,08 g/120 ml dH2O, които са статистически по-високи от стойността на LC50. 0,211 g/120 ml dH2O (Таблица 3). Стойностите на LC90 на DFP, IG, PG и Ls са съответно 0,376, 0,275, 0,137 и 0,074 g/120 ml dH2O (Таблица 2). Най-високата концентрация на DPP е 0,12 g/120 ml dH2O. След 24 часа оценка, средната смъртност на ларвите е само 12%, докато средната смъртност на ларвите на IG и PG достига съответно 51% и 82%. След 24 часа оценка, средната смъртност на ларвите за най-високата концентрация на третиране със семенно брашно от Ls (0,075 g/120 ml dH2O) е била 99% (фиг. 1А).
Кривите на смъртност бяха оценени от дозата-отговор (Probit) на ларвите на Ae. Egyptian (ларви на 3-ти стадий) към концентрацията на семенно брашно 24 часа (A) и 72 часа (B) след третирането. Пунктираната линия представлява LC50 на третирането със семенно брашно. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Топлинно инактивиран Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
При 72-часова оценка, стойностите на LC50 за DFP, IG и PG семенно брашно са съответно 0,111, 0,085 и 0,051 g/120 ml dH2O. Почти всички ларви, изложени на Ls семенно брашно, са умрели след 72 часа експозиция, така че данните за смъртността са несъвместими с Probit анализа. В сравнение с други семенни брашна, ларвите са били по-малко чувствителни към третиране със DFP семенно брашно и са имали статистически по-високи LC50 стойности (Таблици 2 и 3). След 72 часа, стойностите на LC50 за третиране със DFP, IG и PG се оценяват на съответно 0,111, 0,085 и 0,05 g/120 ml dH2O. След 72 часа оценка, стойностите на LC90 за DFP, IG и PG семенни прахове са съответно 0,215, 0,254 и 0,138 g/120 ml dH2O. След 72 часа оценка, средната смъртност на ларвите за третиранията със семенно брашно DFP, IG и PG при максимална концентрация от 0,12 g/120 ml dH2O е била съответно 58%, 66% и 96% (фиг. 1B). След 72-часова оценка, се установи, че семенното брашно PG е по-токсично от семенното брашно IG и DFP.
Синтетичните изотиоцианати, алил изотиоцианат (AITC), бензил изотиоцианат (BITC) и 4-хидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC) могат ефективно да убиват ларвите на комарите. 24 часа след третирането, BITC е по-токсичен за ларвите със стойност на LC50 от 5,29 ppm в сравнение с 19,35 ppm за AITC и 55,41 ppm за 4-HBITC (Таблица 4). В сравнение с AITC и BITC, 4-HBITC има по-ниска токсичност и по-висока стойност на LC50. Има значителни разлики в токсичността на двата основни изотиоцианата (Ls и PG) за ларвите на комарите в най-мощното семенно брашно. Токсичността, базирана на съотношението на леталните дози на LC50 стойностите между AITC, BITC и 4-HBITC, показва статистическа разлика, така че 95% CI на съотношението на леталните дози LC50 не включва стойност от 1 (P = 0,05, Таблица 4). Най-високите концентрации както на BITC, така и на AITC са оценени като убиващи 100% от тестваните ларви (Фигура 2).
Кривите на смъртност бяха оценени от дозата и отговора (Probit) на Ae. 24 часа след третирането, египетските ларви (ларви в 3-ти стадий) достигнаха концентрации на синтетичен изотиоцианат. Пунктираната линия представлява LC50 за третиране с изотиоцианат. Бензил изотиоцианат BITC, алил изотиоцианат AITC и 4-HBITC.
Използването на растителни биопестициди като средства за борба с векторите на комари е отдавна проучвано. Много растения произвеждат естествени химикали, които имат инсектицидна активност37. Техните биоактивни съединения предоставят привлекателна алтернатива на синтетичните инсектициди с голям потенциал за борба с вредителите, включително комарите.
Синапените растения се отглеждат като култура заради семената им, използват се като подправка и източник на масло. Когато синапеното масло се извлича от семената или когато горчицата се извлича за употреба като биогориво, 69 страничният продукт е обезмаслено семенно брашно. Това семенно брашно запазва много от естествените си биохимични компоненти и хидролитични ензими. Токсичността на това семенно брашно се дължи на производството на изотиоцианати 55, 60, 61. Изотиоцианатите се образуват чрез хидролиза на глюкозинолати от ензима мирозиназа по време на хидратацията на семенното брашно 38, 55, 70 и е известно, че имат фунгицидни, бактерицидни, нематоцидни и инсектицидни ефекти, както и други свойства, включително химични сензорни ефекти и химиотерапевтични свойства 61, 62, 70. Няколко проучвания показват, че синапените растения и семенното брашно действат ефективно като фумиганти срещу почвени и складирани хранителни вредители 57, 59, 71, 72. В това проучване оценихме токсичността на брашното от четири зърна и неговите три биоактивни продукта AITC, BITC и 4-HBITC върху ларвите на комарите Aedes. Aedes aegypti. Очаква се добавянето на брашно от семена директно към вода, съдържаща ларви на комари, да активира ензимни процеси, които произвеждат изотиоцианати, токсични за ларвите на комарите. Тази биотрансформация беше демонстрирана отчасти от наблюдаваната ларвицидна активност на брашното от семена и загуба на инсектицидна активност, когато брашното от семена на джуджеста горчица е било термично обработено преди употреба. Очаква се термичната обработка да разруши хидролитичните ензими, които активират глюкозинолатите, като по този начин предотвратява образуването на биоактивни изотиоцианати. Това е първото проучване, което потвърждава инсектицидните свойства на прах от зелеви семена срещу комари във водна среда.
Сред тестваните прахове от семена, прахът от семена на кресон (Ls) е най-токсичен, причинявайки висока смъртност на Aedes albopictus. Ларвите на Aedes aegypti са обработвани непрекъснато в продължение на 24 часа. Останалите три вида прахове от семена (PG, IG и DFP) показват по-бавна активност и все още причиняват значителна смъртност след 72 часа непрекъсната обработка. Само брашното от семена на Ls съдържа значителни количества глюкозинолати, докато PG и DFP съдържат мирозиназа, а IG съдържа глюкозинолат като основен глюкозинолат (Таблица 1). Глюкотропаелинът се хидролизира до BITC, а синалбинът се хидролизира до 4-HBITC61,62. Резултатите от нашия биологичен анализ показват, че както брашното от семена на Ls, така и синтетичният BITC са силно токсични за ларвите на комарите. Основният компонент на брашното от семена на PG и DFP е мирозиназа глюкозинолат, който се хидролизира до AITC. AITC е ефективен при убиване на ларви на комари с LC50 стойност от 19,35 ppm. В сравнение с AITC и BITC, 4-HBITC изотиоцианатът е най-малко токсичен за ларвите. Въпреки че AITC е по-малко токсичен от BITC, техните LC50 стойности са по-ниски от много етерични масла, тествани върху ларви на комари32,73,74,75.
Нашият прах от семена на кръстоцветни растения за употреба срещу ларви на комари съдържа един основен глюкозинолат, представляващ над 98-99% от общите глюкозинолати, определено чрез HPLC. Открити са следи от други глюкозинолати, но нивата им са по-малки от 0,3% от общите глюкозинолати. Прахът от семена на кресон (L. sativum) съдържа вторични глюкозинолати (синигрин), но делът им е 1% от общите глюкозинолати и съдържанието им е все още незначително (около 0,4 mg/g прах от семена). Въпреки че PG и DFP съдържат един и същ основен глюкозинолат (мирозин), ларвицидната активност на техните семенни шротове се различава значително поради техните LC50 стойности. Варира в токсичността към брашнеста мана. Появата на ларви на Aedes aegypti може да се дължи на разлики в мирозиназната активност или стабилност между двете семенни шротове. Мирозиназната активност играе важна роля в бионаличността на хидролизни продукти като изотиоцианати в растенията Brassicaceae76. Предишни доклади на Pocock et al.77 и Wilkinson et al.78 показват, че промените в активността и стабилността на мирозиназата могат да бъдат свързани и с генетични и екологични фактори.
Очакваното съдържание на биоактивен изотиоцианат беше изчислено въз основа на LC50 стойностите на всяко семенно брашно на 24 и 72 часа (Таблица 5) за сравнение със съответните химически приложения. След 24 часа изотиоцианатите в семенното брашно бяха по-токсични от чистите съединения. LC50 стойностите, изчислени въз основа на части на милион (ppm) от третиранията на семена с изотиоцианат, бяха по-ниски от LC50 стойностите за приложенията BITC, AITC и 4-HBITC. Наблюдавахме ларви, консумиращи пелети от семенно брашно (Фигура 3А). Следователно, ларвите могат да получат по-концентрирано излагане на токсични изотиоцианати чрез поглъщане на пелети от семенно брашно. Това беше най-очевидно при третиранията със семенно брашно IG и PG при 24-часова експозиция, където концентрациите на LC50 бяха съответно със 75% и 72% по-ниски от третиранията с чист AITC и 4-HBITC. Третиранията с Ls и DFP бяха по-токсични от чистия изотиоцианат, със стойности на LC50 съответно с 24% и 41% по-ниски. Ларвите в контролната група успешно се какавидираха (фиг. 3B), докато повечето ларви в групата със семенно брашно не се какавидираха и развитието на ларвите беше значително забавено (фиг. 3B,D). При Spodopteralitura изотиоцианатите са свързани със забавяне на растежа и развитие79.
Ларвите на комарите Ae. Aedes aegypti са били непрекъснато изложени на прах от семена на Brassica в продължение на 24–72 часа. (A) Мъртви ларви с частици семенно брашно в устните (оградени с кръгчета); (B) Контролно третиране (dH20 без добавено семенно брашно) показва, че ларвите растат нормално и започват да какавидират след 72 часа (C, D) Ларвите, третирани със семенно брашно; семенното брашно показва разлики в развитието и не какавидира.
Не сме изследвали механизма на токсичните ефекти на изотиоцианатите върху ларвите на комарите. Предишни проучвания върху червени огнени мравки (Solenopsis invicta) обаче показват, че инхибирането на глутатион S-трансферазата (GST) и естеразата (EST) е основният механизъм на биоактивността на изотиоцианатите, а AITC, дори при ниска активност, може също да инхибира GST активността. Дозата е 0,5 µg/ml80. За разлика от това, AITC инхибира ацетилхолинестеразата при възрастни царевични хоботници (Sitophilus zeamais)81. Подобни проучвания трябва да се проведат, за да се изясни механизмът на изотиоцианатната активност при ларвите на комарите.
Използваме третиране с инактивиран с топлина DFP (Dispersive Food Process - брашно от синапено семе), за да подкрепим предположението, че хидролизата на растителните глюкозинолати до образуване на реактивни изотиоцианати служи като механизъм за контрол на ларвите на комарите чрез брашно от синапено семе. Брашното от DFP-HT не е токсично при тестваните дози на приложение. Lafarga et al.82 съобщават, че глюкозинолатите са чувствителни към разграждане при високи температури. Очаква се също термичната обработка да денатурира ензима мирозиназа в брашното от семе и да предотврати хидролизата на глюкозинолатите до образуване на реактивни изотиоцианати. Това беше потвърдено и от Okunade et al.75, които показаха, че мирозиназата е чувствителна към температура, показвайки, че активността на мирозиназата е напълно инактивирана, когато семената от синап, черен синап и кървав корен са били изложени на температури над 80°C. Тези механизми могат да доведат до загуба на инсектицидна активност на термично обработеното брашно от DFP.
Следователно, брашното от синапено семе и неговите три основни изотиоцианати са токсични за ларвите на комарите. Предвид тези разлики между брашното от семе и химическите обработки, използването на брашно от семе може да бъде ефективен метод за контрол на комарите. Необходимо е да се идентифицират подходящи формулировки и ефективни системи за доставяне, за да се подобри ефикасността и стабилността на използването на прахове от семена. Нашите резултати показват потенциалното използване на брашно от синапено семе като алтернатива на синтетичните пестициди. Тази технология може да се превърне в иновативен инструмент за контрол на векторите на комари. Тъй като ларвите на комарите виреят във водна среда, а глюкозинолатите в брашното от семе се ензимно превръщат в активни изотиоцианати при хидратация, използването на брашно от синапено семе във вода, заразена с комари, предлага значителен потенциал за контрол. Въпреки че ларвицидната активност на изотиоцианатите варира (BITC > AITC > 4-HBITC), необходими са още изследвания, за да се определи дали комбинирането на брашно от семе с множество глюкозинолати синергично увеличава токсичността. Това е първото проучване, което демонстрира инсектицидните ефекти на обезмаслено брашно от кръстоцветни семена и три биоактивни изотиоцианати върху комарите. Резултатите от това проучване откриват нови възможности, като показват, че обезмасленото брашно от зелеви семена, страничен продукт от извличането на масло от семената, може да служи като обещаващо ларвицидно средство за борба с комарите. Тази информация може да помогне за по-нататъшното откриване на агенти за биоконтрол на растенията и тяхното разработване като евтини, практични и екологично чисти биопестициди.
Генерираните за това проучване набори от данни и получените анализи са достъпни от съответния автор при разумно искане. В края на проучването всички използвани в него материали (насекоми и семенно брашно) бяха унищожени.
Време на публикуване: 29 юли 2024 г.