Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, който използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добри резултати ви препоръчваме да използвате по-нова версия на вашия браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние показваме сайта без стилове или JavaScript.
Откриването и ползотворното използване на природни продукти може да помогне за подобряване на човешкия живот.Инхибиращите растежа на растенията химикали се използват широко като хербициди за борба с плевелите.Поради необходимостта от използване на различни видове хербициди, съществува необходимост от идентифициране на съединения с нови механизми на действие.В това проучване открихме ново N-алкоксипиролно съединение, кумамонамид, от Streptomyces werraensis MK493-CF1 и установихме пълния процес на синтез.Чрез анализи на биологичната активност ние открихме, че урс-моноаминовата киселина е синтетичен междинен продукт на урс-моноамид и потенциаленинхибитор на растежа на растенията.В допълнение, ние разработихме различни производни на урбенонова киселина, включително производното на урбенилокси (UDA), което има висока хербицидна активност, без да повлиява отрицателно растежа на HeLa клетките.Открихме също, че производните на урмотоновата киселина разрушават растителните микротубули;в допълнение, KAND засяга актиновите нишки и индуцира клетъчна смърт;Тези многостранни ефекти се различават от тези на известните инхибитори на микротубулите и предполагат нов механизъм на действие за урсоновата киселина, което представлява важно предимство при разработването на нови хербициди.
Откриването и практическото приложение на полезни природни продукти и техните производни е средство за подобряване качеството на човешкия живот.Вторичните метаболити, произведени от микроорганизми, растения и насекоми, са довели до голям напредък в медицината и селското стопанство.Много антибиотици и лекарства против левкемия са разработени от естествени продукти.Освен това различни видовепестициди, фунгицидите и хербицидите се извличат от тези природни продукти за използване в селското стопанство.По-специално, хербицидите за борба с плевелите са важни инструменти за увеличаване на добивите от култури в съвременното земеделие и различни видове съединения вече се използват в търговската мрежа.Няколко клетъчни процеса в растенията, като фотосинтеза, метаболизъм на аминокиселини, синтез на клетъчна стена, регулиране на митозата, сигнализиране на фитохормони или протеинов синтез, се считат за типични цели на хербицидите.Съединенията, които инхибират функцията на микротубулите, са често срещан клас хербициди, които влияят върху растежа на растенията чрез повлияване на митотичната регулация2.
Микротубулите са компоненти на цитоскелета и са широко запазени в еукариотните клетки.Тубулиновият хетеродимер се състои от α-тубулин и β-тубулин, образуващи линейни микротубулни протофиламенти, с 13 протофиламента, образуващи цилиндрична структура.Микротубулите играят множество роли в растителните клетки, включително определяне на клетъчната форма, клетъчното делене и вътреклетъчния транспорт3,4.Растителните клетки съдържат микротубули под интерфазната плазмена мембрана и се смята, че тези така наречени кортикални микротубули контролират организацията на целулозните микрофибрили чрез регулиране на целулозни синтазни комплекси 4,5.Кортикалните микротубули на кореновите епидермални клетки, присъстващи в зоната на бързо удължаване на върха на корена, са разположени странично, а целулозните микрофибри следват тези микротубули и ограничават посоката на клетъчна експанзия, като по този начин насърчават анизотропното клетъчно удължаване.Следователно функцията на микротубулите е тясно свързана с морфологията на растенията.Заместванията на аминокиселини в гени, кодиращи тубулин, причиняват изкривяване на кортикалните микротубулни масиви и ляво- или дясностранен растеж в Arabidopsis 6,7.По подобен начин, мутациите в протеини, свързани с микротубули, които регулират динамиката на микротубулите, също могат да доведат до изкривен растеж на корените8,9,10,11,12,13.В допълнение, третирането с хербициди, разрушаващи микротубулите, като дизопирамид, известен също като претилахлор, също причинява ляво наклонен коренов растеж14.Тези данни показват, че прецизното регулиране на функцията на микротубулите е критично за определяне на посоката на растеж на растенията.
Открити са различни видове инхибитори на микротубулите и тези лекарства са допринесли значително за изследването на цитоскелета, както и за селското стопанство и медицината2.По-специално, оризалин, динитроанилинови съединения, дизопирамид, бензамидни съединения и техните аналози могат да инхибират функцията на микротубулите и по този начин да инхибират растежа на растенията.Поради това те се използват широко като хербициди.Въпреки това, тъй като микротубулите са важен компонент на растителни и животински клетки, повечето инхибитори на микротубулите са цитотоксични и за двата вида клетки.Следователно, въпреки признатата им полезност като хербициди, ограничен брой антимикротубулни агенти се използват за практически цели.
Streptomyces е род от семейство Streptomyces, който включва аеробни, грам-положителни, нишковидни бактерии и е широко известен със способността си да произвежда широк спектър от вторични метаболити.Поради това се смята за един от най-важните източници на нови биологично активни природни продукти.В настоящото проучване ние открихме ново съединение, наречено кумамонамид, което беше изолирано от Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. С помощта на спектрален анализ и пълен спектрален анализ беше характеризирана структурата на кумамонамид и неговият уникален N-алкоксипиролов скелет беше определено.синтез.Установено е, че урмоновата киселина, синтетичен междинен продукт на урсмоноамид и неговите производни, инхибира растежа и покълването на популярното моделно растение Arabidopsis thaliana.В изследване на връзката структура-активност открихме, че съединение с C9, модифицирано до урсонова киселина, наречено нонилокси производно на урсоновата киселина (KAND), значително подобрява инхибиторния ефект върху растежа и покълването.Трябва да се отбележи, че новооткритият инхибитор на растежа на растенията също повлиява растежа на тютюна и черния дроб и не е цитотоксичен за бактерии или HeLa клетки.Освен това, някои производни на урмотоновата киселина индуцират изкривен коренов фенотип, което означава, че тези производни пряко или косвено засягат микротубулите.В съответствие с тази идея, нашите наблюдения на микротубули, маркирани имунохистохимично или с флуоресцентни протеини, показват, че лечението с KAND деполимеризира микротубулите.В допълнение, лечението с производни на кумамотоновата киселина разрушава актиновите микрофиламенти.Така ние открихме нов инхибитор на растежа на растенията, чийто уникален механизъм на действие включва разрушаване на цитоскелета.
Щам MK493-CF1 е изолиран от почвата в Shinagawa-ku, Токио.Щам MK493-CF1 образува добре разклонен стромален мицел.Определя се частичната последователност на 16S рибозомния РНК ген (1422 bp).Този щам е много подобен на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типичен щам, 99,93%).Въз основа на този резултат беше установено, че този щам е тясно свързан с типовия щам на S. werraensis.Ето защо ние временно нарекохме този щам S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T също произвежда същите биоактивни съединения.Тъй като имаше малко ранни изследвания за получаване на естествени продукти от този микроорганизъм, бяха проведени допълнителни химически изследвания.След култивиране на S. werraensis MK493-CF1 върху ечемична среда чрез ферментация в твърдо състояние при 30°С в продължение на 14 дни, средата се екстрахира с 50% EtOH.60 ml от пробата се изсушава до получаване на 59.5 mg суров екстракт.Суровият екстракт се подлага на HPLC с обърната фаза, за да се получи N-метокси-1Н-пирол-2-карбоксамид (1, наречен кумамонамид, 36.0 mg).Общото количество на 1 е приблизително 60% от суровия екстракт.Затова решихме да проучим подробно свойствата на кумамотоамид 1.
Кумамонамид 1 е бял аморфен прах и масспектрометрия с висока разделителна способност (HRESIMS) потвърждава C6H8N2O2 (фиг. 1).С2-заместеният пиролов фрагмент на това съединение се характеризира с δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH в 1H NMR спектър: 4.5 Hz , H-5) и δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), а 13C NMR спектърът показва наличието на четири sp2 въглеродни атома.Наличието на амидна група в С2 позиция се оценява чрез HMBC корелация от С-3 протона към амидния карбонил въглерод при δC 161.1.В допълнение, 1Н и 13С NMR пикове при δH 4.10 (3H, S) и δC 68.3 показват наличието на N-метокси групи в молекулата.Въпреки че правилната позиция на метокси групата все още не е определена с помощта на спектроскопски анализ като спектроскопия с подобрена разлика и ядрено съкращение на Overhauser (NOEDF), N-метокси-1Н-пирол-2-карбоксамидът стана първото кандидат съединение.
За да се определи правилната структура на 1, беше извършен пълен синтез (фиг. 2а).Третирането на наличния в търговската мрежа 2-аминопиридин 2 с m-CPBA води до съответния N-оксид 3 в количествен добив.След 2-аминоазидирането на 2, реакцията на циклокондензация, описана от Абрамович, се провежда в бензен при 90°C, за да се получи желаният 1-хидрокси-1Н-пирол-2-карбонитрил 5 в грамове.Скорост 60% (два етапа).15,16.След това метилирането и хидролизата на 4 дават 1-метокси-1Н-пирол-2-карбоксилна киселина (наречена "кумотонова киселина", 6) с добър добив (70%, две стъпки).Накрая, амидиране чрез междинно съединение 6 на киселинен хлорид с използване на воден разтвор на амоняк дава Кумамото амид 1 с 98% добив.Всички спектрални данни на синтезирания 1 бяха подобни на изолирания 1, така че беше определена структурата на 1;
Общ синтез и анализ на биологичната активност на урбенамид и урбенова киселина.(а) Пълен синтез на Кумамото амид.(b) Седемдневни разсад от див тип Arabidopsis Columbia (Col) се отглеждат върху плочи Murashige и Skoog (MS), съдържащи кумамонамид 6 или кумамонамид 1 в посочените концентрации.Мащаб = 1 см.
Първо, ние оценихме биологичните активности на урбенамид и неговите междинни продукти за способността им да модулират растежа на растенията.Добавихме различни концентрации на урсмонамид 1 или урсмонова киселина 6 към MS агарна среда и култивирахме разсад на Arabidopsis thaliana върху тази среда.Тези анализи показват, че високите концентрации (500 μM) на 6 инхибират растежа на корена (фиг. 2b).След това генерирахме различни производни, като заместихме позицията N1 на 6 и извършихме проучвания на връзката структура-активност върху тях (процесът на аналогов синтез е описан в Подкрепящата информация (SI)).Разсадът на Arabidopsis се отглежда в среда, съдържаща 50 μM производни на урсоновата киселина, и се измерва дължината на корена.както е показано на снимката.Както е показано на фигури 3a, b и S1, кумамо киселините имат различни дължини на линейни алкокси вериги (9, 10, 11, 12 и 13) или големи алкокси вериги (15, 16 и 17) на N1 позиция.Производните показват значително инхибиране на растежа на корените.Освен това открихме, че прилагането на 200 μM 10, 11 или 17 инхибира покълването (фигури 3c и S2).
Изследване на връзката структура-активност на Кумамото амид и сродни съединения.(а) Структура и схема на синтез на аналози.( b ) Количествено определяне на дължината на корена на 7-дневни разсад, отгледани на MS среда със или без 50 μM кумамонамидни производни.Звездичките показват значителни разлики с фиктивното лечение (t тест, стр< 0,05).n>18. Данните са показани като средна стойност ± SD.nt означава „нетествано“, защото повече от 50% от семената не са покълнали.( c ) Количествено определяне на скоростта на покълване на третирани семена, инкубирани в продължение на 7 дни в MS среда със или без 200 μM кумамонамид и сродни съединения.Звездичките показват значителни разлики с фиктивното лечение (хи-квадрат тест).n=96.
Интересно е, че добавянето на алкилови странични вериги, по-дълги от С9, намалява инхибиторната активност, което предполага, че свързаните с кумамотонова киселина съединения изискват странични вериги с определен размер, за да проявят своята биологична активност.
Тъй като анализът на връзката структура-активност показа, че C9 е модифициран до урсонова киселина и нонилокси производното на урсоновата киселина (наричано по-нататък KAND 11) е най-ефективният инхибитор на растежа на растенията, ние проведохме по-подробна характеристика на KAND 11. Лечение на Arabidopsis с 50 μM KAND 11 почти напълно предотвратява покълването, докато по-ниски концентрации (40, 30, 20 или 10 μM) на KAND 11 инхибират растежа на корените по дозозависим начин (фиг. 4a, b).За да проверим дали KAND 11 влияе върху жизнеспособността на кореновата меристема, ние изследвахме кореновата меристема, оцветена с пропидиев йодид (PI) и измерихме размера на площта на меристема.Размерът на меристемата на разсад, отгледан върху среда, съдържаща 25 μM KAND-11, е 151.1 ± 32.5 μm, докато размерът на меристема на разсад, отгледан върху контролна среда, съдържаща DMSO, е 264.7 ± 30.8 μm (фиг. 4c, d) , което показва, че KAND-11 възстановява клетъчната активност.разпространяване.Коренна меристема.В съответствие с това, лечението с KAND 11 намалява количеството на маркера за клетъчно делене CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS сигнал в кореновата меристема (фиг. 4e) 17 .Тези резултати показват, че KAND 11 инхибира растежа на корена чрез намаляване на активността на клетъчната пролиферация.
Анализ на инхибиторния ефект на производни на урбеноновата киселина (урбенилокси производни) върху растежа.( а ) 7-дневни разсад от див тип Col, отгледани на MS плаки с посочените концентрации на KAND 11. Мащабна лента = 1 cm.(b) Количествено определяне на дължината на корена.Буквите показват значителни разлики (HSD тест в Турция, стр< 0,05).n>16. Данните са показани като средна стойност ± SD.( c ) Конфокална микроскопия на оцветени с пропидиев йодид див тип Col корени, отгледани върху MS плаки със или без 25 μM KAND 11. Белите скоби показват кореновата меристема.Мащабна лента = 100 µm.(d) Количествено определяне на размера на кореновата меристема (n = 10 до 11).Статистическите разлики бяха определени с помощта на t-тест (стр< 0,05).Стълбчетата представляват средния размер на меристема.(д) Микроскопия с диференциален интерферентен контраст (DIC) на коренова меристема, съдържаща конструкцията CDKB2;1про: CDKB2;1-GUS оцветени и оцветени върху 5-дневни разсади, отгледани върху MS плаки със или без 25 µM KAND анализ.
Фитотоксичността на KAND 11 беше допълнително тествана с помощта на друго двусемеделно растение, тютюн (Nicotiana tabacum), и основен организъм модел на сухоземно растение, черен дроб (Marchantia polymorpha).Както в случая с Arabidopsis, разсадът на тютюн SR-1, отгледан върху среда, съдържаща 25 μM KAND 11, произвежда по-къси корени (фиг. 5а).Освен това, 40 от 48 семена покълнаха върху плочи, съдържащи 200 μM KAND 11, докато всичките 48 семена покълнаха върху фиктивно третирана среда, което показва, че по-високите концентрации на KAND са значителни (p< 0,05;чи тест -квадрат) инхибира покълването на тютюна.(фиг. 5b).В допълнение, концентрацията на KAND 11, която инхибира бактериалния растеж в чернодробния лист, е подобна на ефективната концентрация в Arabidopsis (фиг. 5в).Тези резултати показват, че KAND 11 може да инхибира растежа на различни растения.След това изследвахме възможната цитотоксичност на съединения, свързани с моноамид на мечка, в други организми, а именно човешки HeLa клетки и щам Escherichia coli DH5α, като представители съответно на висши животински и бактериални клетки.В серия от анализи на клетъчна пролиферация, ние наблюдавахме, че кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 и KAND 11 не повлияват растежа на HeLa или Е. coli клетки при концентрации от 100 μM (фиг. 5d, e).
Инхибиране на растежа на KAND 11 в организми, различни от Arabidopsis.( а ) Двуседмични разсад от див тип SR-1 тютюн се отглеждат върху вертикално разположени MS плаки, съдържащи 25 μM KAND 11. ( б ) Двуседмични разсад от див тип SR-1 тютюн се отглеждат върху хоризонтално разположени MS плочи, съдържащи 200 μM KAND 11. ( c ) Двуседмични пъпки от див тип Tak-1 чернодробна трева, отгледани върху плочи Gamborg B5 с посочените концентрации на KAND 11. Червените стрелки показват спори, които са спрели да растат в рамките на двуседмичната инкубация Период.(d) Анализ на клетъчна пролиферация на HeLa клетки.Броят на жизнеспособните клетки се измерва на фиксирани интервали от време с помощта на комплект за броене на клетки 8 (Dojindo).Като контрола, HeLa клетките бяха третирани с 5 μg/ml актиномицин D (Act D), който инхибира транскрипцията на РНК полимераза и причинява клетъчна смърт.Анализите бяха извършени в три екземпляра.(e) Анализ на клетъчна пролиферация на Е. coli.Растежът на Е. coli се анализира чрез измерване на OD600.Като контрола клетките бяха третирани с 50 μg/ml ампицилин (Amp), който инхибира синтеза на бактериална клетъчна стена.Анализите бяха извършени в три екземпляра.
За да дешифрираме механизма на действие на цитотоксичността, причинена от съединения, свързани с урамид, ние анализирахме повторно производни на урбенова киселина с умерен инхибиторен ефект.както е показано на снимката.Както е показано на фигури 2b, 6a, разсад, отгледан върху агарови плаки, съдържащи високи концентрации (200 μM) урмотонова киселина 6, произвежда по-къси и извити наляво корени (θ = – 23,7 ± 6,1), докато разсад, отгледан върху контролна среда, разсадът дава почти прави корени (θ = – 3,8 ± 7,1).Известно е, че този характерен наклонен растеж е резултат от дисфункция на кортикалните микротубули 14, 18.В съответствие с това откритие, дестабилизиращите микротубулите лекарства дизопирамид и оризалин предизвикват подобно накланяне на корена при нашите условия на растеж (Фигури 2b, 6a).В същото време тествахме производни на урмотоновата киселина и избрахме няколко от тях, които при определени концентрации предизвикват наклонен растеж на корена.Съединения 8, 9 и 15 променят посоката на растеж на корените съответно при 75 μM, 50 μM и 40 μM, което показва, че тези съединения могат ефективно да дестабилизират микротубулите (Фиг. 2b, 6a).Ние също тествахме най-мощното производно на урсоловата киселина, KAND 11, при по-ниска концентрация (15 µM) и открихме, че прилагането на KAND 11 инхибира растежа на корените и че посоката на растеж на корените е неравномерна, въпреки че има тенденция да се наклоняват наляво ( Фигура C3)..Тъй като по-високите концентрации на лекарства, дестабилизиращи микротубулите, понякога инхибират растежа на растенията, вместо да причинят накланяне на корените, впоследствие оценихме възможността KAND 11 да повлияе на микротубулите чрез наблюдение на кортикалните микротубули в кореновите епидермални клетки.Имунохистохимията, използваща анти-β-тубулинови антитела в епидермални клетки на корени на разсад, третирани с 25 μM KAND 11, показва изчезването на почти всички кортикални микротубули в епидермалните клетки в зоната на удължаване (Фиг. 6b).Тези резултати показват, че кумамотонова киселина и нейните производни действат директно или индиректно върху микротубулите, за да ги разрушат и че тези съединения са нови инхибитори на микротубулите.
Урсоновата киселина и нейните производни променят кортикалните микротубули в Arabidopsis thaliana.( а ) Ъгъл на наклон на корена, измерен в присъствието на различни производни на урмотоновата киселина при посочените концентрации.Ефектите на две съединения, за които е известно, че инхибират микротубулите: дизопирамид и оризалин също бяха анализирани.Вмъкването показва стандарта, използван за измерване на ъгъла на растеж на корена.Звездичките показват значителни разлики с фиктивното лечение (t тест, стр< 0,05).n>19. Мащаб = 1 cm.( b ) Кортикални микротубули в епидермалните клетки в зоната на удължаване.Микротубулите в корените на Arabidopsis Col от див тип, отгледани върху MS плаки със или без 25 μM KAND 11, се визуализират чрез имунохистохимично оцветяване, използвайки β-тубулин първични антитела и Alexa Fluor-конюгирани вторични антитела.Мащабна лента = 10 µm.( c ) Митотична структура на микротубулите в кореновата меристема.Микротубулите се визуализират с помощта на имунохистохимично оцветяване.Митотичните структури, включително профазни зони, вретена и фрагмопласти, бяха преброени от конфокални изображения.Стрелките показват митотични микротубулни структури.Звездичките показват значителни разлики с фиктивното лечение (t тест, стр< 0,05).n>9. Скала = 50 µm.
Въпреки че Ursa има способността да нарушава функцията на микротубулите, неговият механизъм на действие се очаква да бъде различен от типичните деполимеризиращи микротубули агенти.Например, по-високи концентрации на микротубулни деполимеризиращи агенти като дизопирамид и оризалин предизвикват анизотропно разширяване на епидермалните клетки, докато KAND 11 не го прави.В допълнение, съвместното прилагане на KAND 11 и дизопирамид доведе до комбиниран отговор на растежа на корена, индуциран от дизопирамид, и се наблюдава инхибиране на растежа, индуцирано от KAND 11 (фиг. S4).Ние също анализирахме отговора на свръхчувствителния дизопирамид 1-1 (phs1-1) мутант към KAND 11. phs1-1 има неканонична точкова мутация на тубулин киназа и произвежда по-къси корени, когато се третира с дизопирамид9,20.phs1-1 мутантните разсади, отгледани върху агарна среда, съдържаща KAND 11, имат по-къси корени, подобни на тези, отгледани върху дизопирамида (фиг. S5).
В допълнение, ние наблюдавахме митотични микротубулни структури, като профазни зони, вретена и фрагмопласти, в кореновата меристема на разсад, третирани с KAND 11. В съответствие с наблюденията за CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, значително намаление на наблюдаван е броят на митотичните микротубули (фиг. .6c).
За да характеризираме цитотоксичността на KAND 11 при субклетъчна разделителна способност, ние третирахме суспензионни клетки от тютюн BY-2 с KAND 11 и наблюдавахме техния отговор.Първо добавихме KAND 11 към BY-2 клетки, експресиращи TagRFP-TUA6, които флуоресцентно маркират микротубулите, за да оценим ефекта на KAND 11 върху кортикалните микротубули.Плътността на кортикалните микротубули се оценява с помощта на анализ на изображението, който определя количествено процента на цитоскелетните пиксели сред цитоплазмените пиксели.Резултатите от анализа показват, че след третиране с 50 μM или 100 μM KAND 11 за 1 час, плътността намалява значително до 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28%, съответно, докато плътността на клетките, третирани с DMSO, възлиза на 1,61 ± 0,34 % (фиг. 7а).Тези резултати са в съответствие с наблюдението в Arabidopsis, че лечението с KAND 11 индуцира деполимеризация на кортикалните микротубули (фиг. 6b).Ние също така изследвахме линията BY-2 с маркирани с GFP-ABD актинови нишки след третиране със същата концентрация на KAND 11 и наблюдавахме, че лечението с KAND 11 разруши актиновите филаменти.Третирането с 50 μM или 100 μM KAND 11 в продължение на 1 час значително намалява плътността на актиновата нишка до 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26%, съответно, докато плътността в третираните с DMSO клетки е 1,69 ± 0,51% (фиг. 2).7б).Тези резултати контрастират с ефектите на пропизамид, който не засяга актиновите нишки, и латрункулин В, актинов деполимеризатор, който не засяга микротубулите (SI Фигура S6).В допълнение, лечението с кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 или KAND 11 не повлиява микротубулите в HeLa клетки (SI фигура S7).По този начин се смята, че механизмът на действие на KAND 11 е различен от този на известните разрушители на цитоскелета.В допълнение, нашето микроскопско наблюдение на BY-2 клетки, третирани с KAND 11, разкри началото на клетъчна смърт по време на лечението с KAND 11 и показа, че делът на оцветените в синьо Evans мъртви клетки не се увеличава значително след 30 минути лечение с KAND 11, докато след 90 минути лечение с 50 µM или 100 µM KAND, броят на мъртвите клетки се увеличава съответно до 43,7% или 80,1% (фиг. 7в).Взети заедно, тези данни показват, че новото производно на урсоловата киселина KAND 11 е специфичен за растението цитоскелетен инхибитор с неизвестен досега механизъм на действие.
KAND засяга кортикалните микротубули, актинови нишки и жизнеспособността на тютюневите BY-2 клетки.( а ) Визуализация на кортикални микротубули в BY-2 клетки в присъствието на TagRFP-TUA6.BY-2 клетки, третирани с KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO, бяха изследвани чрез конфокална микроскопия.Плътността на кортикалните микротубули се изчислява от микрографии на 25 независими клетки.Буквите показват значителни разлики (HSD тест в Турция, стр< 0,05).Мащабна лента = 10 µm.( b ) Кортикални актинови филаменти в BY-2 клетки, визуализирани в присъствието на GFP-ABD2.BY-2 клетки, третирани с KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO, бяха изследвани чрез конфокална микроскопия.Плътността на кортикалните актинови нишки се изчислява от микрографии на 25 независими клетки.Буквите показват значителни разлики (HSD тест в Турция, стр< 0,05).Мащабна лента = 10 µm.( c ) Наблюдение на мъртви BY-2 клетки чрез оцветяване със синьо на Evans.BY-2 клетки, третирани с KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO, бяха изследвани чрез микроскопия в светло поле.n=3.Мащабна лента = 100 µm.
Откриването и прилагането на нови природни продукти доведе до значителен напредък в различни аспекти на човешкия живот, включително медицината и селското стопанство.Проведени са исторически изследвания за получаване на полезни съединения от природни ресурси.По-специално, известно е, че актиномицетите са полезни като антипаразитни антибиотици за нематоди поради способността им да произвеждат различни вторични метаболити като авермектин, водещото съединение на ивермектин и блеомицин и неговите производни, използвани медицински като противораково средство 21, 22.По същия начин са открити различни хербицидни съединения от актиномицети, някои от които вече се използват в търговската мрежа1,23.Следователно анализът на метаболити на актиномицети за изолиране на природни продукти с желани биологични активности се счита за ефективна стратегия.В това проучване ние открихме ново съединение, кумамонамид, от S. werraensis и успешно го синтезирахме.Урсоновата киселина е синтетичен междинен продукт на урбенамид и неговите производни.Може да причини характерно извиване на корените, да прояви умерена до силна хербицидна активност и да увреди пряко или косвено растителните микротубули.Въпреки това, механизмът на действие на урмотоничната киселина може да се различава от този на съществуващите инхибитори на микротубулите, тъй като KAND 11 също разрушава актиновите филаменти и причинява клетъчна смърт, което предполага регулаторен механизъм, чрез който урмотоновата киселина и нейните производни влияят върху широк спектър от цитоскелетни структури..
По-нататъшното подробно характеризиране на урбеноновата киселина ще помогне за по-доброто разбиране на механизма на действие на урбеноновата киселина.По-специално, следващата цел е да се оцени способността на урсоновата киселина да се свързва с редуцирани микротубули, за да се определи дали урсоновата киселина и нейните производни действат директно върху микротубулите и ги деполимеризират, или дали тяхното действие води до дестабилизация на микротубулите.Освен това, в случай, че микротубулите не са директна цел, идентифицирането на мястото на действие и молекулярните мишени на урсоновата киселина върху растителните клетки ще помогне за по-нататъшното разбиране на свойствата на свързаните съединения и възможните начини за подобряване на хербицидната активност.Нашият анализ на биоактивност разкрива уникалната цитотоксична способност на урсоновата киселина върху растежа на растения като Arabidopsis thaliana, тютюн и черен дроб, като нито E. coli, нито HeLa клетките са засегнати.Слаба или никаква токсичност за животинските клетки е предимство на производните на урсоновата киселина, ако са разработени като хербициди за използване в открити земеделски полета.Наистина, тъй като микротубулите са често срещани структури в еукариотите, тяхното селективно инхибиране в растенията е ключово изискване за хербицидите.Например, пропизамид, микротубулен деполимеризиращ агент, който директно се свързва с тубулина и инхибира полимеризацията, се използва като хербицид поради неговата ниска токсичност за животинските клетки24.За разлика от дизопирамида, сродните бензамиди имат различна целева специфичност.В допълнение към растителните микротубули, RH-4032 или бензоксамидът също инхибира микротубулите на животински клетки или съответно оомицети, а залиламидът се използва като фунгицид поради ниската си фитотоксичност25,26,27.Новооткритата мечка и нейните производни проявяват селективна цитотоксичност срещу растенията, но си струва да се отбележи, че по-нататъшни модификации могат да променят тяхната целева специфичност, като потенциално предоставят допълнителни производни за контрол на патогенни гъбички или оомицети.
Уникалните свойства на урбеноновата киселина и нейните производни са полезни за разработването им като хербициди и използването им като изследователски инструменти.Значението на цитоскелета за контролиране на формата на растителната клетка е широко признато.По-ранни проучвания показват, че растенията са развили сложни механизми на организация на кортикалните микротубули чрез контролиране на динамиката на микротубулите, за да контролират правилно морфогенезата.Идентифицирани са голям брой молекули, отговорни за регулирането на активността на микротубулите, и свързаните с тях изследвания все още продължават3,4,28.Сегашното ни разбиране за динамиката на микротубулите в растителните клетки не обяснява напълно механизмите на организацията на кортикалните микротубули.Например, въпреки че както дизопирамидът, така и оризалинът могат да деполимеризират микротубулите, дизопирамидът причинява сериозно изкривяване на корена, докато оризалинът има относително лек ефект.Освен това, мутациите в тубулина, който стабилизира микротубулите, също причиняват декстроротация в корените, докато паклитаксел, който също стабилизира динамиката на микротубулите, не го прави.Следователно, изучаването и идентифицирането на молекулярните мишени на урсоловата киселина трябва да осигури нови прозрения за регулирането на растителните кортикални микротубули.По същия начин, бъдещи сравнения на химикали, които са ефективни за насърчаване на изкривен растеж, като дизопирамид, и по-малко ефективни химикали, като оризалин или кумамоторна киселина, ще предоставят улики за това как възниква изкривеният растеж.
От друга страна, свързаните със защитата пренареждания на цитоскелета са друга възможност за обяснение на цитотоксичността на урсоновата киселина.Инфекцията на патоген или въвеждането на елиситор в растителните клетки понякога причинява разрушаване на цитоскелета и последваща клетъчна смърт29.Например, съобщава се, че криптоксантинът, получен от оомицети, разрушава микротубулите и актиновите нишки преди смъртта на тютюневите клетки, подобно на това, което се случва при лечението с KAND30,31.Приликите между защитните реакции и клетъчните реакции, предизвикани от урсоновата киселина, ни накараха да предположим, че те задействат общи клетъчни процеси, въпреки че е очевиден по-бърз и по-силен ефект на урсоновата киселина от криптоксантина.Проучванията обаче показват, че разрушаването на актиновите филаменти насърчава спонтанната клетъчна смърт, която не винаги е придружена от разрушаване на микротубулите29.В допълнение, остава да се види дали патогенът или елиситорът причиняват изкривен растеж на корените, както правят производните на урсоновата киселина.По този начин молекулярното познание, свързващо защитните реакции и цитоскелета, е привлекателен проблем, който трябва да бъде разгледан.Чрез използване на присъствието на съединения с ниско молекулно тегло, свързани с урсоновата киселина, както и набор от производни с различна ефективност, те могат да осигурят възможности за насочване към неизвестни клетъчни механизми.
Взети заедно, откриването и прилагането на нови съединения, които модулират динамиката на микротубулите, ще осигурят мощни методи за справяне със сложните молекулярни механизми, които са в основата на определянето на формата на растителната клетка.В този контекст, наскоро разработеното съединение урмотонова киселина, което засяга микротубулите и актиновите филаменти и предизвиква клетъчна смърт, може да предостави възможност за дешифриране на връзката между контрола на микротубулите и тези други механизми.По този начин химическият и биологичният анализ с помощта на урбенонова киселина ще ни помогне да разберем молекулярните регулаторни механизми, които контролират растителния цитоскелет.
Инокулирайте S. werraensis MK493-CF1 в 500 mL Ерленмайерова колба с прегради, съдържаща 110 mL посевна среда, състояща се от 2% (w/v) галактоза, 2% (w/v) Essence паста, 1% (w/v) Bacto състав .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) екстракт от царевица (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 в дейонизирана вода.(рН 7,4 преди стерилизация).Посевните култури се инкубират на ротационен шейкър (180 rpm) при 27°С в продължение на 2 дни.Производствено култивиране чрез твърда ферментация.Посевната култура (7 ml) се прехвърля в 500 ml K-1 колба, съдържаща 40 g производствена среда, състояща се от 15 g пресован ечемик (MUSO Co., Ltd., Япония) и 25 g дейонизирана вода (рН не е коригирано преди стерилизация).).Ферментацията се провежда при 30°С на тъмно в продължение на 14 дни.Ферментационният материал се екстрахира с 40 ml/бутилка EtOH и се центрофугира (1500 g, 4°C, 10 min).Супернатантът на културата (60 ml) се екстрахира със смес от 10% MeOH/EtOAc.Органичният слой се изпарява при понижено налягане, за да се получи остатък (59,5 mg), който се подлага на HPLC с градиентно елуиране (0–10 минути: 90%) върху колона с обратна фаза (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × дължина 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 минути: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минути: 90% H2O/EtOH, 45–155 минути: 90% H2O /EtOH до 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 минути: 100% EtOH) при скорост на потока 1,5 ml/min, кумамонамид (1, 36,0 mg) се изолира като бял аморфен прах.
Кумамотоамид (1);1H-NMR (500 MHz, CDC13) делта 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4,08 (s, ЗН);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 5 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ изчислена стойност: 141.0659, измерена стойност: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Семената на Columbia (Col-0) са получени от Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) с разрешение за изследователска употреба.Семената Col-0 бяха размножени и поддържани в нашите лабораторни условия и използвани като растения от див тип Arabidopsis.Семената на Arabidopsis бяха повърхностно стерилизирани и култивирани в среда Murashige и Skoog с половин сила, съдържаща 2% захароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)етансулфонова киселина (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) и 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, при 23 °C и постоянна светлина.Семената на мутанта phs1-1 бяха осигурени от Т. Хашимото (Нара Институт за наука и технологии).
Семената от щам SR-1 бяха осигурени от Т. Хашимото (Nara Institute of Science and Technology) и използвани като див тип тютюневи растения.Тютюневите семена се стерилизират повърхностно и се накисват в стерилна вода за три нощи, за да се насърчи покълването, след което се поставят в разтвор с половин концентрация, съдържащ 2% захароза, 0,05% (w/v) MES и 0,8% геланова гума (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге.и среда на Skoog) с рН 5.7 и инкубирани при 23°С при постоянна светлина.
Щам Tak-1 е предоставен от T. Kohchi (Университет на Киото) и е използван като стандартна експериментална единица за изследването на чернодробния пипер.Gemma се получава от стерилизирани култивирани растения и след това се поставя върху среда на Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), съдържаща 1% захароза и 0,3% геланова гума и се инкубира при 23°C при непрекъсната светлина.
Тютюневи BY-2 клетки (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) са предоставени от S. Hasezawa (Университет на Токио).BY-2 клетките се разреждат 95-кратно в модифицирана среда на Linsmeier и Skoog и се допълват всяка седмица с 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина 32 .Клетъчната суспензия се смесва на ротационен шейкър при 130 rpm при 27°С на тъмно.Промийте клетките с 10 пъти по-голям обем от прясна среда и ресуспендирайте в същата среда.BY-2 трансгенни клетъчни линии, стабилно експресиращи микротубулния маркер TagRFP-TUA6 или маркера на актиновия филамент GFP-ABD2 под 35S промотора на мозаечния вирус на карфиола, бяха генерирани, както е описано 33, 34, 35.Тези клетъчни линии могат да се поддържат и синхронизират с помощта на процедури, подобни на тези, използвани за оригиналната BY-2 клетъчна линия.
Клетките HeLa се култивират в модифицирана на Dulbecco среда на Eagle (DMEM) (Life Technologies), допълнена с 10% фетален волски серум, 1,2 U/ml пеницилин и 1,2 μg/ml стрептомицин в 37°C инкубатор с 5% CO2.
Всички експерименти, описани в този ръкопис, са извършени в съответствие с японските разпоредби и указания за биобезопасност.
Съединенията се разтварят в диметилсулфоксид (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) като изходни разтвори и се разреждат в MS среда за Arabidopsis и тютюн или Gamborg B5 среда за чернодробна мъст.За теста за инхибиране на растежа на корените, повече от 10 семена на блюдо бяха засети върху агарна среда, съдържаща посочените съединения или DMSO.Семената се инкубират в камера за растеж в продължение на 7 дни.Разсадът е заснет и е измерена дължината на корените.За анализ на кълняемостта на Arabidopsis, 48 семена на блюдо се засяват върху агарна среда, съдържаща 200 μM съединение или DMSO.Семената на Arabidopsis се отглеждат в камера за растеж и броят на покълналите разсад се преброява 7 дни след покълването (dag).За анализ на покълването на тютюна, 24 семена на плоча се засяват върху агарна среда, съдържаща 200 μM KAND или DMSO.Тютюневите семена се отглеждат в камера за растеж и броят на покълналите разсад се преброява след 14 дни.За теста за инхибиране на растежа на чернодробна трева, 9 ембриона от всяко блюдо се поставят върху агарна среда, съдържаща посочените концентрации на KAND или DMSO, и се инкубират в камера за растеж в продължение на 14 дни.
Използвайте разсад, оцветен с 5 mg/ml пропидиев йодид (PI), за да визуализирате организацията на кореновата меристема.PI сигналите се наблюдават чрез флуоресцентна микроскопия с помощта на TCS SPE конфокален лазерен сканиращ микроскоп (Leica Microsystems).
Хистохимичното оцветяване на корените с β-глюкуронидаза (GUS) се извършва съгласно протокола, описан от Malami и Benfey36.Разсадът се фиксира в 90% ацетон за една нощ, оцветява се с 0.5 mg/ml 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-d-глюкуронова киселина в GUS буфер за 1 час и се поставя в хидратиран разтвор на хлоралдехид.(8 g хлоралхидрат, 2 ml вода и 1 ml глицерол) и се наблюдава чрез контрастна микроскопия с диференциална интерференция с помощта на микроскоп Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Ъглите на корените бяха измерени на 7-дневни разсад, отгледани върху вертикално поставени плочи.Измерете ъгъла на корена спрямо посоката на вектора на гравитацията, както е описано в стъпка 6.
Подреждането на кортикалните микротубули се наблюдава, както е описано, с незначителни модификации на протокола 37 .Анти-β-тубулиново антитяло (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и Alexa Fluor 488-конюгиран анти-миши IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) бяха използвани като първични и вторични антитела при разреждания 1:1000 и 1:100, съответно.Флуоресцентните изображения бяха получени с помощта на TCS SPE конфокален лазерен сканиращ микроскоп (Leica Microsystems).Придобийте Z-stack изображения и създайте проекции с максимален интензитет според инструкциите на производителя.
Тестът за клетъчна пролиферация на HeLa се извършва с помощта на комплект за броене на клетки 8 (Dojindo) съгласно инструкциите на производителя.
Растежът на Е. coli DH5α се анализира чрез измерване на клетъчната плътност в култура с помощта на спектрофотометър при 600 nm (OD600).
Цитоскелетната организация в трансгенни BY-2 клетки се наблюдава с помощта на флуоресцентен микроскоп, оборудван с конфокално сканиращо устройство CSU-X1 (Yokogawa) и sCMOS камера (Zyla, Andor Technology).Плътността на цитоскелета се оценява чрез анализ на изображението, който определя количествено процента на цитоскелетните пиксели сред цитоплазмените пиксели в конфокални изображения, използвайки софтуера ImageJ, както е описано 38, 39.
За да се открие клетъчна смърт в BY-2 клетки, аликвотна част от клетъчната суспензия се инкубира с 0,05% Evans blue за 10 минути при стайна температура.Селективното оцветяване със синьо на Evans на мъртвите клетки зависи от екструзията на багрилото от жизнеспособни клетки от интактната плазмена мембрана40.Оцветените клетки се наблюдават с помощта на микроскоп със светло поле (BX53, Olympus).
Клетките HeLa се отглеждат в DMEM, допълнен с 10% FBS в овлажнен инкубатор при 37°C и 5% CO2.Клетките бяха третирани със 100 μM KAND 11, кумамонамидна киселина 6, кумамонамид 1, 100 ng/ml колцемид (Gibco) или 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) в продължение на 6 часа при 37 ° С.Клетките се фиксират с MetOH за 10 минути и след това с ацетат за 5 минути при стайна температура.Фиксираните клетки се инкубират с β-тубулиново първично антитяло (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разредено в 0,5% BSA/PBS за 2 часа, промиват се 3 пъти с TBST и след това се инкубират с Alexa Fluor козе антитяло.488 1 час.– Миши IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 ng/ml 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), разреден в 0,5% BSA/PBS.След промиване с TBST три пъти, оцветените клетки се наблюдават на обърнат микроскоп Nikon Eclipse Ti-E.Изображенията бяха заснети с охладена камера Hamamatsu ORCA-R2 CCD с помощта на софтуер MetaMorph (Molecular Devices).
Време на публикуване: 17 юни 2024 г