Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена CSS поддръжка. За най-добри резултати ви препоръчваме да използвате по-нова версия на браузъра си (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилизиране или JavaScript.
Откриването и полезното използване на природни продукти може да помогне за подобряване на човешкия живот. Химикалите, инхибиращи растежа на растенията, се използват широко като хербициди за борба с плевелите. Поради необходимостта от използване на различни видове хербициди, е необходимо да се идентифицират съединения с нови механизми на действие. В това проучване открихме ново N-алкоксипироловo съединение, кумамонамид, от Streptomyces werraensis MK493-CF1 и установихме пълния процес на синтез. Чрез анализи на биологичната активност открихме, че урс-моноаминовата киселина е синтетичен междинен продукт на урс-моноамид и потенциален...инхибитор на растежа на растениятаОсвен това, разработихме различни производни на урбенонова киселина, включително урбенилокси производното (UDA), което има висока хербицидна активност, без да влияе негативно на растежа на HeLa клетките. Установихме също, че производните на урмотоновата киселина разрушават растителните микротубули; освен това, KAND засяга актиновите филаменти и индуцира клетъчна смърт; Тези многостранни ефекти се различават от тези на известните инхибитори на микротубулите и предполагат нов механизъм на действие на урсоновата киселина, което представлява важно предимство при разработването на нови хербициди.
Откриването и практическото приложение на полезни природни продукти и техните производни е средство за подобряване на качеството на човешкия живот. Вторичните метаболити, произвеждани от микроорганизми, растения и насекоми, са довели до голям напредък в медицината и селското стопанство. Много антибиотици и лекарства против левкемия са разработени от природни продукти. Освен това, различни видове...пестицидиФунгицидите и хербицидите се извличат от тези природни продукти за употреба в селското стопанство. По-специално, хербицидите за борба с плевелите са важни инструменти за увеличаване на добивите в съвременното земеделие и различни видове съединения вече се използват в търговската мрежа. Няколко клетъчни процеса в растенията, като фотосинтеза, метаболизъм на аминокиселините, синтез на клетъчна стена, регулиране на митозата, сигнализация на фитохормони или синтез на протеини, се считат за типични мишени на хербицидите. Съединенията, които инхибират функцията на микротубулите, са често срещан клас хербициди, които влияят на растежа на растенията, като повлияват митотичната регулация2.
Микротубулите са компоненти на цитоскелета и са широко консервирани в еукариотните клетки. Тубулиновият хетеродимер се състои от α-тубулин и β-тубулин, образуващи линейни микротубулни протофиламенти, като 13 протофиламента образуват цилиндрична структура. Микротубулите играят множество роли в растителните клетки, включително определяне на клетъчната форма, клетъчното делене и вътреклетъчния транспорт3,4. Растителните клетки съдържат микротубули под интерфазната плазмена мембрана и се смята, че тези така наречени кортикални микротубули контролират организацията на целулозните микрофибрили чрез регулиране на целулозно-синтазните комплекси4,5. Кортикалните микротубули на кореновите епидермални клетки, намиращи се в зоната на бързо удължаване на върха на корена, са разположени странично, а целулозните микрофибри следват тези микротубули и ограничават посоката на клетъчно разширяване, като по този начин насърчават анизотропното клетъчно удължаване. Следователно, функцията на микротубулите е тясно свързана с морфологията на растенията. Аминокиселинните замествания в гените, кодиращи тубулин, причиняват изкривяване на кортикалните микротубулни масиви и растеж вляво или вдясно при Arabidopsis6,7. По подобен начин, мутации в протеините, свързани с микротубулите, които регулират динамиката на микротубулите, също могат да доведат до нарушен растеж на корените8,9,10,11,12,13. Освен това, третирането с хербициди, разрушаващи микротубулите, като дизопирамид, известен също като претилахлор, също причинява лявостранен кос растеж на корените14. Тези данни показват, че прецизното регулиране на функцията на микротубулите е от решаващо значение за определяне на посоката на растеж на растенията.
Открити са различни видове инхибитори на микротубулите и тези лекарства са допринесли значително за изследванията на цитоскелета, както и за селското стопанство и медицината2. По-специално, оризалин, динитроанилинови съединения, дизопирамид, бензамид-сродни съединения и техните аналози могат да инхибират функцията на микротубулите и по този начин да инхибират растежа на растенията. Следователно, те се използват широко като хербициди. Тъй като обаче микротубулите са важен компонент на растителните и животинските клетки, повечето инхибитори на микротубулите са цитотоксични и за двата типа клетки. Следователно, въпреки признатата им полезност като хербициди, ограничен брой антимикротубулни агенти се използват за практически цели.
Streptomyces е род от семейство Streptomyces, който включва аеробни, грам-положителни, нишковидни бактерии и е широко известен със способността си да произвежда широк спектър от вторични метаболити. Следователно, той се счита за един от най-важните източници на нови биологично активни природни продукти. В настоящото проучване открихме ново съединение, наречено кумамонамид, което беше изолирано от Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. Чрез спектрален анализ и пълен спектрален анализ беше характеризирана структурата на кумамонамид и беше определен неговият уникален N-алкоксипиролов скелет. Урсмоновата киселина, синтетичен междинен продукт на урсмонамид и неговите производни, беше установено, че инхибира растежа и покълването на популярното моделно растение Arabidopsis thaliana. В проучване на връзката структура-активност открихме, че съединение с C9 модифициран до урсонова киселина, наречено нонилокси производно на урсонова киселина (KAND), значително усилва инхибиторния ефект върху растежа и покълването. Забележително е, че новооткритият инхибитор на растежа на растенията е повлиял и на растежа на тютюна и чернодробната мъх и не е бил цитотоксичен за бактерии или HeLa клетки. Освен това, някои производни на урматонова киселина индуцират изкривен коренов фенотип, което предполага, че тези производни пряко или косвено влияят на микротубулите. В съответствие с тази идея, нашите наблюдения на микротубули, маркирани имунохистохимично или с флуоресцентни протеини, показват, че KAND третирането деполимеризира микротубулите. Освен това, третирането с производни на кумамотонова киселина разрушава актиновите микрофиламенти. По този начин открихме нов инхибитор на растежа на растенията, чийто уникален механизъм на действие включва разрушаване на цитоскелета.
Щам MK493-CF1 е изолиран от почва в Шинагава-ку, Токио. Щамът MK493-CF1 образува добре разклонен стромален мицел. Определена е частичната последователност на 16S рибозомния РНК ген (1422 bp). Този щам е много подобен на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типичен щам, 99.93%). Въз основа на този резултат беше установено, че този щам е тясно свързан с типовия щам на S. werraensis. Следователно, ние предварително нарекохме този щам S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T също произвежда същите биоактивни съединения. Тъй като е имало малко ранни изследвания за получаване на природни продукти от този микроорганизъм, бяха проведени допълнителни химични изследвания. След култивиране на S. werraensis MK493-CF1 върху ечемичена среда чрез твърдофазна ферментация при 30°C в продължение на 14 дни, средата беше екстрахирана с 50% EtOH. 60 ml проба бяха изсушени, за да се получат 59,5 mg суров екстракт. Суровият екстракт беше подложен на обратнофазова HPLC, за да се получи N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид (1, наречен кумамонамид, 36,0 mg). Общото количество на 1 е приблизително 60% от суровия екстракт. Поради това решихме да проучим подробно свойствата на кумамоамид 1.
Кумамонамид 1 е бял аморфен прах и масспектрометрията с висока резолюция (HRESIMS) потвърждава C6H8N2O2 (фиг. 1). C2-заместеният пиролов фрагмент на това съединение се характеризира с δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH в 1H NMR спектър: 4.5 Hz, H-5) и δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), а 13C NMR спектърът показва наличието на четири sp2 въглеродни атома. Наличието на амидна група в позиция C2 беше оценено чрез HMBC корелация от C-3 протона до амидния карбонилен въглерод при δC 161.1. В допълнение, 1H и 13C NMR пикове при δH 4.10 (3H, S) и δC 68.3 показват наличието на N-метокси групи в молекулата. Въпреки че правилната позиция на метокси групата все още не е била определена с помощта на спектроскопски анализ, като например усилена диференциална спектроскопия и ядрен Overhauser abruation (NOEDF), N-метокси-1H-пирол-2-карбоксамид става първото кандидат съединение.
За да се определи правилната структура на 1, беше извършен пълен синтез (фиг. 2а). Третирането на търговски достъпния 2-аминопиридин 2 с m-CPBA доведе до съответния N-оксид 3 с количествен добив. След 2-аминоазидирането на 2, описаната от Абрамович реакция на циклокондензация беше проведена в бензен при 90°C, за да се получи желаният 1-хидрокси-1H-пирол-2-карбонитрил 5 в грамове. Скорост 60% (два етапа). 15,16. Метилирането и хидролизата на 4 след това дадоха 1-метокси-1H-пирол-2-карбоксилна киселина (наречена „кумотонова киселина“, 6) с добър добив (70%, два етапа). Накрая, амидирането чрез междинен киселинен хлорид 6, използвайки воден амоняк, даде Кумамото амид 1 с 98% добив. Всички спектрални данни на синтезирания 1 бяха подобни на изолирания 1, така че структурата на 1 беше определена;
Общ синтез и анализ на биологичната активност на урбенамид и урбенова киселина. (а) Пълен синтез на Кумамото амид. (б) Седемдневни разсади от див тип Arabidopsis Columbia (Col) са отгледани върху плаки Murashige и Skoog (MS), съдържащи кумамонамид 6 или кумамонамид 1 в посочените концентрации. Мащабна лента = 1 cm.
Първо, оценихме биологичната активност на урбенамид и неговите междинни продукти по отношение на способността им да модулират растежа на растенията. Добавихме различни концентрации на урсмонамид 1 или урсмонова киселина 6 към MS агарова среда и култивирахме разсад от Arabidopsis thaliana върху тази среда. Тези анализи показаха, че високи концентрации (500 μM) на 6 инхибират растежа на корените (фиг. 2b). След това генерирахме различни производни чрез заместване на N1 позицията на 6 и проведохме изследвания на връзката структура-активност върху тях (процесът на аналогов синтез е описан в допълнителната информация (SI)). Разсадът от Arabidopsis беше отгледан върху среда, съдържаща 50 μM производни на урсонова киселина, и беше измерена дължината на корените, както е показано на снимката. Както е показано на фигури 3a, b и S1, кумамо киселините имат различна дължина на линейни алкокси вериги (9, 10, 11, 12 и 13) или големи алкокси вериги (15, 16 и 17) в N1 позиция. Производните показаха значително инхибиране на растежа на корените. Освен това, установихме, че прилагането на 200 μM 10, 11 или 17 инхибира покълването (фиг. 3в и S2).
Изследване на връзката структура-активност на Кумамото амид и сродни съединения. (а) Структура и схема на синтез на аналози. (б) Количествено определяне на дължината на корените на 7-дневни разсад, отглеждани в MS среда със или без 50 μM производни на кумамонамид. Звездичките показват значителни разлики с плацебо третирането (t-тест, p< 0,05). n>18. Данните са показани като средна стойност ± SD. nt означава „не е тествано“, защото повече от 50% от семената не са покълнали. (c) Количествено определяне на степента на покълване на третирани семена, инкубирани в продължение на 7 дни в MS среда със или без 200 μM кумамонамид и сродни съединения. Звездичките показват значителни разлики с плацебо третирането (хи-квадрат тест). n=96.
Интересно е, че добавянето на алкилови странични вериги, по-дълги от C9, намалява инхибиторната активност, което предполага, че съединенията, свързани с кумамотова киселина, изискват странични вериги с определен размер, за да проявят своята биологична активност.
Тъй като анализът на връзката структура-активност показа, че C9 е модифициран до урсонова киселина и нонилокси производното на урсоновата киселина (наричано по-долу KAND 11) е най-ефективният инхибитор на растежа на растенията, ние проведохме по-подробна характеристика на KAND 11. Третирането на Arabidopsis с 50 μM KAND 11 почти напълно предотвратява покълването, докато по-ниските концентрации (40, 30, 20 или 10 μM) на KAND 11 инхибират растежа на корените по дозозависим начин (фиг. 4a, b). За да проверим дали KAND 11 влияе върху жизнеспособността на кореновите меристеми, изследвахме кореновите меристеми, оцветени с пропидиев йодид (PI), и измерихме размера на площта на меристемата. Размерът на меристемата на разсад, отглеждан в среда, съдържаща 25 μM KAND-11, е 151,1 ± 32,5 μm, докато размерът на меристемата на разсад, отглеждан в контролна среда, съдържаща DMSO, е 264,7 ± 30,8 μm (фиг. 4c, d), което показва, че KAND-11 възстановява клетъчната активност. разпространяване. Коренова меристема. В съответствие с това, третирането с KAND 11 намалява количеството на сигнала на маркера за клетъчно делене CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS в кореновата меристема (фиг. 4e) 17. Тези резултати показват, че KAND 11 инхибира растежа на корените чрез намаляване на клетъчната пролиферационна активност.
Анализ на инхибиторния ефект на производните на урбеноновата киселина (урбенилокси производни) върху растежа. (а) 7-дневни разсади от див тип Col, отглеждани върху MS плаки с посочените концентрации на KAND 11. Скала = 1 cm. (б) Количествено определяне на дължината на корена. Буквите показват значителни разлики (тест на Tukey HSD, p< 0,05). n>16. Данните са показани като средна стойност ± SD. (c) Конфокална микроскопия на оцветени с пропидиев йодид корени от див тип Col, отгледани върху MS плаки със или без 25 μM KAND 11. Белите скоби показват кореновата меристема. Скала = 100 µm. (d) Количествено определяне на размера на кореновата меристема (n = 10 до 11). Статистическите разлики са определени с помощта на t-тест (p< 0,05). Стълбовете представляват средния размер на меристема. (e) Диференциална интерферентна контрастна (DIC) микроскопия на коренова меристема, съдържаща CDKB2 конструкцията; 1pro: CDKB2; 1-GUS оцветени и оцветени върху 5-дневни разсад, отглеждани върху MS плаки със или без 25 µM KAND анализ.
Фитотоксичността на KAND 11 беше допълнително тествана с помощта на друго двусемеделно растение, тютюн (Nicotiana tabacum), и основен моделен организъм на сухоземно растение, чернодробна мъх (Marchantia polymorpha). Както в случая с Arabidopsis, разсадът на тютюн SR-1, отглеждан върху среда, съдържаща 25 μM KAND 11, е произвел по-къси корени (фиг. 5а). Освен това, 40 от 48 семена са покълнали върху плаки, съдържащи 200 μM KAND 11, докато всичките 48 семена са покълнали върху симулирано третирана среда, което показва, че по-високите концентрации на KAND са били значителни (p< 0,05; хи-тест - квадрат) инхибира покълването на тютюна. (Фиг. 5b). Освен това, концентрацията на KAND 11, която инхибира бактериалния растеж в чернодробната мъх, е подобна на ефективната концентрация в Arabidopsis (Фиг. 5c). Тези резултати показват, че KAND 11 може да инхибира растежа на различни растения. След това изследвахме възможната цитотоксичност на съединения, свързани с моноамиди на мечки, в други организми, а именно човешки HeLa клетки и щам Escherichia coli DH5α, като представители съответно на висши животински и бактериални клетки. В серия от анализи на клетъчна пролиферация наблюдавахме, че кумамонамид 1, кумамонамидната киселина 6 и KAND 11 не повлияват растежа на HeLa или E. coli клетки при концентрации от 100 μM (Фиг. 5d,e).
Инхибиране на растежа на KAND 11 в организми, различни от Arabidopsis. (a) Двуседмични разсади от див тип SR-1 тютюн са отгледани върху вертикално разположени MS плаки, съдържащи 25 μM KAND 11. (b) Двуседмични разсади от див тип SR-1 тютюн са отгледани върху хоризонтално разположени MS плаки, съдържащи 200 μM KAND 11. (c) Двуседмични пъпки от див тип Tak-1 чернодробна мъх, отгледани върху Gamborg B5 плаки с посочените концентрации на KAND 11. Червените стрелки показват спори, които са спрели да растат в рамките на двуседмичния инкубационен период. (d) Анализ на клетъчната пролиферация на HeLa клетки. Броят на жизнеспособните клетки е измерен през фиксирани интервали от време с помощта на комплект за броене на клетки 8 (Dojindo). Като контрола, HeLa клетките са третирани с 5 μg/ml актиномицин D (Act D), който инхибира транскрипцията на РНК полимераза и причинява клетъчна смърт. Анализите са извършени в три екземпляра. (e) Анализ на клетъчната пролиферация на E. coli. Растежът на E. coli е анализиран чрез измерване на OD600. Като контрола, клетките бяха третирани с 50 μg/ml ампицилин (Amp), който инхибира синтеза на бактериалната клетъчна стена. Анализите бяха проведени в три екземпляра.
За да дешифрираме механизма на действие на цитотоксичността, причинена от съединения, свързани с урамид, ние повторно анализирахме производни на урбенова киселина с умерени инхибиторни ефекти, както е показано на снимката. Както е показано на фигури 2b, 6a, разсадът, отглеждан върху агарови плаки, съдържащи високи концентрации (200 μM) урмотонова киселина 6, е произвел по-къси и извити наляво корени (θ = – 23.7 ± 6.1), докато разсадът, отглеждан върху контролната среда, е произвел почти прави корени (θ = – 3.8 ± 7.1). Известно е, че този характерен кос растеж е резултат от дисфункция на кортикалните микротубули14,18. В съответствие с това откритие, дестабилизиращите микротубулите лекарства дизопирамид и оризалин са индуцирали подобно накланяне на корените при нашите условия на растеж (фиг. 2b, 6a). В същото време тествахме производни на урмотонова киселина и избрахме няколко от тях, които при определени концентрации са индуцирали кос растеж на корените. Съединения 8, 9 и 15 промениха посоката на растеж на корените съответно при 75 μM, 50 μM и 40 μM, което показва, че тези съединения могат ефективно да дестабилизират микротубулите (фиг. 2b, 6a). Тествахме и най-мощното производно на урсолова киселина, KAND 11, при по-ниска концентрация (15 µM) и установихме, че прилагането на KAND 11 инхибира растежа на корените и че посоката на растеж на корените е неравномерна, въпреки че те са склонни да се наклоняват наляво (фигура C3). Тъй като по-високите концентрации на лекарства, дестабилизиращи микротубулите, понякога инхибират растежа на растенията, вместо да причиняват накланяне на корените, впоследствие оценихме възможността KAND 11 да влияе на микротубулите, като наблюдавахме кортикалните микротубули в епидермалните клетки на корените. Имунохистохимията, използваща анти-β-тубулинови антитела в епидермалните клетки на корените на разсада, третирани с 25 μM KAND 11, показа изчезването на почти всички кортикални микротубули в епидермалните клетки в зоната на удължаване (фиг. 6b). Тези резултати показват, че кумамотоновата киселина и нейните производни действат директно или индиректно върху микротубулите, за да ги разрушат, и че тези съединения са нови инхибитори на микротубулите.
Урсоновата киселина и нейните производни променят кортикалните микротубули в Arabidopsis thaliana. (a) Ъгъл на наклон на корена, измерен в присъствието на различни производни на урмотоновата киселина в посочените концентрации. Анализирани са и ефектите на две съединения, за които е известно, че инхибират микротубулите: дизопирамид и оризалин. Вложката показва стандарта, използван за измерване на ъгъла на растеж на корена. Звездичките показват значителни разлики с плацебо третирането (t-тест, p< 0,05). n>19. Мащабна лента = 1 см. (б) Кортикални микротубули в епидермални клетки в зоната на удължаване. Микротубулите в корени от див тип Arabidopsis Col, отглеждани върху MS плаки със или без 25 μM KAND 11, бяха визуализирани чрез имунохистохимично оцветяване, използвайки първични антитела срещу β-тубулин и вторични антитела, конюгирани с Alexa Fluor. Мащабна лента = 10 µm. (в) Митотична структура на микротубулите в кореновата меристема. Митотичните структури, включително профазни зони, вретена и фрагмопласти, бяха преброени от конфокални изображения. Стрелките показват митотични структури на микротубулите. Звездичките показват значителни разлики с плацебо третиране (t-тест, p< 0,05). n>9. Мащабна лента = 50 µm.
Въпреки че Ursa има способността да нарушава функцията на микротубулите, очаква се механизмът му на действие да е различен от типичните агенти за деполимеризиране на микротубулите. Например, по-високи концентрации на агенти за деполимеризиране на микротубулите, като дизопирамид и оризалин, индуцират анизотропно разширяване на епидермалните клетки, докато KAND 11 не го прави. Освен това, едновременното приложение на KAND 11 и дизопирамид доведе до комбиниран дизопирамид-индуциран отговор на растежа на корените и беше наблюдавано инхибиране на растежа, индуцирано от KAND 11 (фиг. S4). Анализирахме също така отговора на свръхчувствителния дизопирамид 1-1 (phs1-1) мутант към KAND 11. phs1-1 има неканонична точкова мутация на тубулин киназата и произвежда по-къси корени, когато е третиран с дизопирамид9,20. Разсадът с мутант phs1-1, отглеждан върху агарова среда, съдържаща KAND 11, имаше по-къси корени, подобни на тези, отглеждани върху дизопирамид (фиг. S5).
Освен това, наблюдавахме митотични микротубулни структури, като профазни зони, вретена и фрагмопласти, в кореновата меристема на разсад, третиран с KAND 11. В съответствие с наблюденията за CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, се наблюдава значително намаляване на броя на митотичните микротубули (фиг. .6в).
За да характеризираме цитотоксичността на KAND 11 при субклетъчна резолюция, третирахме суспензионни клетки от тютюн BY-2 с KAND 11 и наблюдавахме техния отговор. Първо добавихме KAND 11 към BY-2 клетки, експресиращи TagRFP-TUA6, който флуоресцентно маркира микротубули, за да оценим ефекта на KAND 11 върху кортикалните микротубули. Плътността на кортикалните микротубули беше оценена с помощта на анализ на изображения, който количествено определи процента на цитоскелетните пиксели сред цитоплазмените пиксели. Резултатите от анализа показаха, че след третиране с 50 μM или 100 μM KAND 11 за 1 час, плътността намалява значително до 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28%, съответно, докато плътността на клетките, третирани с DMSO, възлиза на 1,61 ± 0,34% (фиг. 7а). Тези резултати са в съответствие с наблюдението при Arabidopsis, че третирането с KAND 11 индуцира деполимеризация на кортикалните микротубули (фиг. 6б). Също така изследвахме линията BY-2 с GFP-ABD-маркирани актинови филаменти след третиране със същата концентрация на KAND 11 и наблюдавахме, че третирането с KAND 11 нарушава актиновите филаменти. Третирането с 50 μM или 100 μM KAND 11 за 1 час значително намалява плътността на актиновите филаменти до 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26%, съответно, докато плътността в третираните с DMSO клетки е 1,69 ± 0,51% (фиг. 2). 7b). Тези резултати контрастират с ефектите на пропизамид, който не засяга актиновите филаменти, и латрункулин B, актинов деполимеризатор, който не засяга микротубулите (фигура S6 от SI). Освен това, третирането с кумамонамид 1, кумамонамидна киселина 6 или KAND 11 не повлиява микротубулите в HeLa клетките (фигура S7 от SI). Следователно, счита се, че механизмът на действие на KAND 11 е различен от този на известните цитоскелетни разрушители. Освен това, нашето микроскопско наблюдение на BY-2 клетки, третирани с KAND 11, разкри началото на клетъчна смърт по време на третирането с KAND 11 и показа, че делът на мъртвите клетки, оцветени с Evans blue, не се е увеличил значително след 30 минути третиране с KAND 11, докато след 90 минути третиране с 50 μM или 100 μM KAND, броят на мъртвите клетки се е увеличил съответно до 43,7% или 80,1% (фиг. 7в). Взети заедно, тези данни показват, че новото производно на урсоловата киселина KAND 11 е специфичен за растенията цитоскелетен инхибитор с неизвестен досега механизъм на действие.
KAND влияе върху кортикалните микротубули, актиновите филаменти и жизнеспособността на тютюневите BY-2 клетки. (a) Визуализация на кортикалните микротубули в BY-2 клетки в присъствието на TagRFP-TUA6. BY-2 клетки, третирани с KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO, бяха изследвани чрез конфокална микроскопия. Плътността на кортикалните микротубули беше изчислена от микрографии на 25 независими клетки. Буквите показват значителни разлики (тест на Tukey HSD, p< 0,05). Мащабна лента = 10 µm. (b) Кортикални актинови филаменти в BY-2 клетки, визуализирани в присъствието на GFP-ABD2. BY-2 клетки, третирани с KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO, бяха изследвани чрез конфокална микроскопия. Плътността на кортикалните актинови филаменти беше изчислена от микрографии на 25 независими клетки. Буквите показват значителни разлики (тест на Tukey HSD, p< 0,05). Скала = 10 µm. (c) Наблюдение на мъртви BY-2 клетки чрез оцветяване с Evans blue. BY-2 клетки, третирани с KAND 11 (50 μM или 100 μM) или DMSO, бяха изследвани чрез светлополева микроскопия. n=3. Скала = 100 µm.
Откриването и прилагането на нови природни продукти доведе до значителен напредък в различни аспекти на човешкия живот, включително медицината и селското стопанство. Проведени са исторически изследвания за получаване на полезни съединения от природни ресурси. По-специално, актиномицетите са известни като полезни като антипаразитни антибиотици за нематоди поради способността им да произвеждат различни вторични метаболити, като авермектин, водещото съединение на ивермектина, и блеомицин и неговите производни, използвани в медицината като противораково средство21,22. По същия начин, от актиномицетите са открити различни хербицидни съединения, някои от които вече се използват комерсиално1,23. Следователно, анализът на метаболитите на актиномицетите за изолиране на природни продукти с желана биологична активност се счита за ефективна стратегия. В това проучване открихме ново съединение, кумамонамид, от S. werraensis и го синтезирахме успешно. Урсоновата киселина е синтетичен междинен продукт на урбенамид и неговите производни. Тя може да причини характерно извиване на корените, да проявява умерена до силна хербицидна активност и директно или индиректно да уврежда растителните микротубули. Механизмът на действие на урмотоновата киселина обаче може да се различава от този на съществуващите инхибитори на микротубулите, тъй като KAND 11 също разрушава актиновите филаменти и причинява клетъчна смърт, което предполага регулаторен механизъм, чрез който урмотоновата киселина и нейните производни влияят върху широк спектър от цитоскелетни структури.
По-нататъшното детайлно характеризиране на урбеноновата киселина ще помогне за по-доброто разбиране на механизма на нейното действие. По-специално, следващата цел е да се оцени способността на урсоновата киселина да се свързва с редуцирани микротубули, за да се определи дали урсоновата киселина и нейните производни действат директно върху микротубулите и ги деполимеризират, или дали действието им води до дестабилизация на микротубулите. Освен това, в случаите, когато микротубулите не са директна цел, идентифицирането на мястото на действие и молекулярните цели на урсоновата киселина върху растителните клетки ще помогне за по-нататъшното разбиране на свойствата на сродните съединения и възможните начини за подобряване на хербицидната активност. Нашият анализ на биоактивността разкри уникалната цитотоксична способност на урсоновата киселина върху растежа на растения като Arabidopsis thaliana, тютюн и чернодробна мъх, докато нито клетките на E. coli, нито HeLa бяха засегнати. Малката или никаква токсичност за животинските клетки е предимство на производните на урсоновата киселина, ако те са разработени като хербициди за употреба в открити земеделски полета. Всъщност, тъй като микротубулите са често срещани структури в еукариотите, тяхното селективно инхибиране в растенията е ключово изискване за хербицидите. Например, пропизамид, агент за деполимеризиране на микротубули, който се свързва директно с тубулин и инхибира полимеризацията, се използва като хербицид поради ниската си токсичност за животинските клетки24. За разлика от дизопирамида, сродните бензамиди имат различна специфичност на действие. В допълнение към растителните микротубули, RH-4032 или бензоксамид също инхибира микротубулите на животинските клетки или оомицетите, съответно, а залиламид се използва като фунгицид поради ниската си фитотоксичност25,26,27. Новооткритият мечок и неговите производни проявяват селективна цитотоксичност срещу растенията, но си струва да се отбележи, че по-нататъшни модификации могат да променят тяхната специфичност на действие, потенциално осигурявайки допълнителни производни за контрол на патогенни гъби или оомицети.
Уникалните свойства на урбеноновата киселина и нейните производни са полезни за тяхното разработване като хербициди и използване като изследователски инструменти. Значението на цитоскелета за контролиране на формата на растителните клетки е широко признато. По-ранни проучвания показват, че растенията са развили сложни механизми за организация на кортикалните микротубули чрез контролиране на динамиката на микротубулите, за да контролират правилно морфогенезата. Идентифицирани са голям брой молекули, отговорни за регулирането на активността на микротубулите, и свързаните с тях изследвания все още продължават3,4,28. Настоящото ни разбиране за динамиката на микротубулите в растителните клетки не обяснява напълно механизмите на организация на кортикалните микротубули. Например, въпреки че както дизопирамидът, така и оризалинът могат да деполимеризират микротубулите, дизопирамидът причинява тежко изкривяване на корените, докато оризалинът има относително лек ефект. Освен това, мутациите в тубулина, който стабилизира микротубулите, също причиняват декстроротация в корените, докато паклитакселът, който също стабилизира динамиката на микротубулите, не го прави. Следователно, изучаването и идентифицирането на молекулярните мишени на урсоловата киселина би трябвало да предостави нови прозрения за регулирането на растителните кортикални микротубули. По същия начин, бъдещи сравнения на химикали, които са ефективни за насърчаване на нарушения растеж, като дизопирамид, и по-малко ефективни химикали, като оризалин или кумамоторна киселина, ще предоставят улики за това как се случва нарушеният растеж.
От друга страна, свързаните със защитата цитоскелетни пренастройки са друга възможност за обяснение на цитотоксичността на урсоновата киселина. Инфекцията с патоген или въвеждането на елиситор в растителните клетки понякога причинява разрушаване на цитоскелета и последваща клетъчна смърт29. Например, съобщава се, че криптоксантин, получен от оомицети, разрушава микротубулите и актиновите филаменти преди смъртта на тютюневите клетки, подобно на това, което се случва при третиране с KAND30,31. Приликите между защитните реакции и клетъчните реакции, индуцирани от урсонова киселина, ни накараха да предположим, че те задействат общи клетъчни процеси, въпреки че е очевиден по-бърз и по-силен ефект на урсоновата киселина, отколкото на криптоксантина. Проучванията обаче показват, че разрушаването на актиновите филаменти насърчава спонтанната клетъчна смърт, която не винаги е съпроводена с разрушаване на микротубулите29. Освен това, остава да се види дали патогенът или елиситорът причиняват нарушен растеж на корените, както правят производните на урсоновата киселина. Следователно, молекулярните познания, свързващи защитните реакции и цитоскелета, са привлекателен проблем, който трябва да бъде разгледан. Чрез използване на наличието на нискомолекулни съединения, свързани с урсоновата киселина, както и на редица производни с различна потентност, те могат да предоставят възможности за насочване към неизвестни клетъчни механизми.
Взети заедно, откриването и прилагането на нови съединения, които модулират динамиката на микротубулите, ще осигурят мощни методи за справяне със сложните молекулярни механизми, лежащи в основата на определянето на формата на растителните клетки. В този контекст, наскоро разработеното съединение урматонова киселина, което влияе върху микротубулите и актиновите филаменти и индуцира клетъчна смърт, може да предостави възможност за дешифриране на връзката между контрола на микротубулите и тези други механизми. По този начин, химичният и биологичният анализ с помощта на урбенонова киселина ще ни помогне да разберем молекулярните регулаторни механизми, които контролират растителния цитоскелет.
Инокулирайте S. werraensis MK493-CF1 в 500 mL ерленмайерова колба с преграда, съдържаща 110 mL посевна среда, състояща се от 2% (w/v) галактоза, 2% (w/v) есенциална паста, 1% (w/v) Bacto-соев хлорид (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) царевичен екстракт (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 и 0.2% CaCO3 в дейонизирана вода. (pH 7.4 преди стерилизация). Посевните култури бяха инкубирани на ротационен шейкър (180 rpm) при 27°C в продължение на 2 дни. Производствено култивиране чрез ферментация в твърдо състояние. Посевната култура (7 ml) беше прехвърлена в 500 ml K-1 колба, съдържаща 40 g производствена среда, състояща се от 15 g пресован ечемик (MUSO Co., Ltd., Япония) и 25 g дейонизирана вода (pH не е коригирано преди стерилизация). Ферментацията беше проведена при 30°C на тъмно в продължение на 14 дни. Ферментационният материал беше екстрахиран с 40 ml/бутилка EtOH и центрофугиран (1500 g, 4°C, 10 min). Супернатантът на културата (60 ml) беше екстрахиран със смес от 10% MeOH/EtOAc. Органичният слой се изпарява под намалено налягане, при което се получава остатък (59,5 mg), който се подлага на HPLC с градиентно елуиране (0–10 минути: 90%) на колона с обратна фаза (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × дължина 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 минути: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минути: 90% H2O/EtOH, 45–155 минути: 90% H2O/EtOH до 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) при скорост на потока 1,5 ml/min, кумамонамид (1, 36,0 mg) се изолира като бял аморфен прах.
Кумамотоамид(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ изчислена стойност: 141.0659, измерена стойност: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Семената от Columbia (Col-0) са получени от Центъра за биологични ресурси за Arabidopsis (ABRC) с разрешение за изследователска употреба. Семената от Col-0 са размножени и поддържани в нашите лабораторни условия и са използвани като растения от див тип Arabidopsis. Семената от Arabidopsis са стерилизирани повърхностно и култивирани в половин концентрация среда Murashige и Skoog, съдържаща 2% захароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-морфолино)етансулфонова киселина (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical).) и 1.5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, при 23°C и постоянна светлина. Семената на мутанта phs1-1 са предоставени от Т. Хашимото (Нара Институт за наука и технологии).
Семената от щам SR-1 бяха предоставени от Т. Хашимото (Нара Институт за наука и технологии) и използвани като див тип тютюневи растения. Тютюневите семена бяха стерилизирани повърхностно и накиснати в стерилна вода в продължение на три нощи, за да се стимулира покълването, след което поставени в разтвор с половин концентрация, съдържащ 2% захароза, 0,05% (w/v) MES и 0,8% геланова гума (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. и Skoog среда) с pH 5,7 и инкубирани при 23°C под постоянна светлина.
Щам Tak-1 е предоставен от Т. Кохчи (Университет Киото) и е използван като стандартна експериментална единица за изследване на чернодробна мъх. Гема е получена от стерилизирани култивирани растения и след това е посята върху среда Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), съдържаща 1% захароза и 0,3% геланова гума, и инкубирана при 23°C под непрекъсната светлина.
Тютюневи BY-2 клетки (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) бяха предоставени от S. Hasezawa (Университет в Токио). BY-2 клетки бяха разредени 95 пъти в модифицирана среда на Linsmeier и Skoog и допълнени ежеседмично с 2,4-дихлорофеноксиоцетна киселина 32. Клетъчната суспензия беше смесена на ротационен шейкър при 130 rpm при 27°C на тъмно. Клетките се измиват с 10 пъти обема на прясна среда и се ресуспендират в същата среда. BY-2 трансгенни клетъчни линии, стабилно експресиращи микротубулния маркер TagRFP-TUA6 или актиновия филаментен маркер GFP-ABD2 под промотора 35S на вируса на мозаеката от карфиол, бяха генерирани както е описано 33,34,35. Тези клетъчни линии могат да бъдат поддържани и синхронизирани, като се използват процедури, подобни на тези, използвани за оригиналната BY-2 клетъчна линия.
HeLa клетките бяха култивирани в модифицирана среда на Dulbecco (DMEM) (Life Technologies), допълнена с 10% фетален говежди серум, 1,2 U/ml пеницилин и 1,2 μg/ml стрептомицин в инкубатор при 37°C с 5% CO2.
Всички експерименти, описани в този ръкопис, са проведени в съответствие с японските разпоредби и насоки за биологична безопасност.
Съединенията бяха разтворени в диметилсулфоксид (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) като основни разтвори и разредени в MS среда за Arabidopsis и тютюн или Gamborg B5 среда за чернодробна мъх. За анализа на инхибиране на растежа на корените, повече от 10 семена на плака бяха засети върху агарова среда, съдържаща посочените съединения или DMSO. Семената бяха инкубирани в растежна камера в продължение на 7 дни. Разсадът беше фотографиран и беше измерена дължината на корените. За анализа на покълването на Arabidopsis, 48 семена на плака бяха засети върху агарова среда, съдържаща 200 μM съединение или DMSO. Семената на Arabidopsis бяха отгледани в растежна камера и броят на покълналите разсад беше преброен 7 дни след покълването (dag). За анализа на покълването на тютюна, 24 семена на плака бяха засети върху агарова среда, съдържаща 200 μM KAND или DMSO. Семената на тютюна бяха отгледани в растежна камера и броят на покълналите разсад беше преброен след 14 дни. За анализа на инхибиране на растежа на чернодробна мъртъвка, 9 ембриона от всяка плака бяха поставени върху агарова среда, съдържаща посочените концентрации на KAND или DMSO, и инкубирани в растежна камера в продължение на 14 дни.
Използвайте разсад, оцветен с 5 mg/ml пропидиев йодид (PI), за да визуализирате организацията на кореновите меристеми. PI сигналите са наблюдавани чрез флуоресцентна микроскопия, използвайки TCS SPE конфокален лазерен сканиращ микроскоп (Leica Microsystems).
Хистохимичното оцветяване на корените с β-глюкуронидаза (GUS) беше извършено съгласно протокола, описан от Malami и Benfey36. Разсадът беше фиксиран в 90% ацетон за една нощ, оцветен с 0,5 mg/ml 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-d-глюкуронова киселина в GUS буфер за 1 час и поставен в хидратиран разтвор на хлоралдехид (8 g хлоралхидрат, 2 ml вода и 1 ml глицерол) и наблюдаван чрез диференциална интерферентна контрастна микроскопия с помощта на микроскоп Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Ъглите на корените бяха измерени на 7-дневни разсади, отглеждани върху вертикално поставени плочи. Измерете ъгъла на корена спрямо посоката на вектора на гравитацията, както е описано в стъпка 6.
Разположението на кортикалните микротубули е наблюдавано както е описано, с малки модификации на протокола 37. Като първични и вторични антитела са използвани анти-β-тубулиново антитяло (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и Alexa Fluor 488-конюгирано анти-мишо IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) при разреждания 1:1000 и 1:100, съответно. Флуоресцентни изображения са получени с помощта на TCS SPE конфокален лазерен сканиращ микроскоп (Leica Microsystems). Получават се Z-stack изображения и се създават проекции с максимална интензивност съгласно инструкциите на производителя.
Анализът на клетъчната пролиферация на HeLa беше извършен с помощта на комплект за броене на клетки 8 (Dojindo) съгласно инструкциите на производителя.
Растежът на E. coli DH5α беше анализиран чрез измерване на клетъчната плътност в културата с помощта на спектрофотометър при 600 nm (OD600).
Цитоскелетната организация в трансгенни BY-2 клетки е наблюдавана с помощта на флуоресцентен микроскоп, оборудван с конфокално сканиращо устройство CSU-X1 (Yokogawa) и sCMOS камера (Zyla, Andor Technology). Плътността на цитоскелета е оценена чрез анализ на изображението, който количествено определя процента на цитоскелетните пиксели сред цитоплазмените пиксели в конфокалните изображения, използвайки софтуера ImageJ, както е описано38,39.
За да се открие клетъчна смърт в BY-2 клетки, аликвотна част от клетъчната суспензия се инкубира с 0,05% Evans blue в продължение на 10 минути при стайна температура. Селективното оцветяване с Evans blue на мъртвите клетки зависи от екструзията на багрилото от жизнеспособните клетки от непокътнатата плазмена мембрана40. Оцветените клетки са наблюдавани с помощта на светлополен микроскоп (BX53, Olympus).
HeLa клетки бяха култивирани в DMEM, допълнена с 10% FBS, в овлажнен инкубатор при 37°C и 5% CO2. Клетките бяха третирани със 100 μM KAND 11, кумамонамидна киселина 6, кумамонамид 1, 100 ng/ml колцемид (Gibco) или 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) в продължение на 6 часа при 37°C. Клетките бяха фиксирани с MetOH за 10 минути и след това с ацетат за 5 минути при стайна температура. Фиксираните клетки бяха инкубирани с първично антитяло β-тубулин (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разредено в 0.5% BSA/PBS за 2 часа, промити 3 пъти с TBST и след това инкубирани с козе антитяло Alexa Fluor. 488 за 1 час. – Миши IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 ng/ml 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), разреден в 0.5% BSA/PBS. След трикратно промиване с TBST, оцветените клетки бяха наблюдавани на инвертен микроскоп Nikon Eclipse Ti-E. Изображенията бяха заснети с охладена CCD камера Hamamatsu ORCA-R2, използвайки софтуера MetaMorph (Molecular Devices).
Време на публикуване: 17 юни 2024 г.