Боровата нематода е карантинен мигриращ ендопаразит, за който е известно, че причинява сериозни икономически загуби в екосистемите на боровата гора. Настоящото изследване разглежда нематицидната активност на халогенирани индоли срещу борови нематоди и техния механизъм на действие. Нематицидните активности на 5-йодоиндол и авермектин (положителна контрола) срещу борови нематоди са сходни и високи при ниски концентрации (10 μg/mL). 5-йодоиндолът намалява плодовитостта, репродуктивната активност, ембрионалната и ларвната смъртност и локомоторното поведение. Молекулните взаимодействия на лиганди със специфични за безгръбначни рецептори на хлоридни канали, свързани с глутамат, подкрепят идеята, че 5-йодоиндолът, подобно на авермектина, се свързва плътно с активното място на рецептора. 5-Йодоиндол също индуцира различни фенотипни деформации в нематодите, включително анормален колапс/свиване на органи и повишена вакуолизация. Тези резултати предполагат, че вакуолите могат да играят роля в смъртта, медиирана от метилиране на нематоди. Важно е, че 5-йодоиндолът не е токсичен и за двата растителни вида (зеле и репички). По този начин, това проучване показва, че прилагането на йодоиндол при условия на околната среда може да контролира нараняването на боровото увяхване.
Нематодът от борова дървесина (Bursaphelenchus xylophilus) принадлежи към нематодите от борова дървесина (PWN), мигриращи ендопаразитни нематоди, за които е известно, че причиняват сериозни екологични щети на екосистемите от борова гора1. Болестта на увяхването на бора (PWD), причинена от нематода от борова дървесина, се превръща в сериозен проблем на няколко континента, включително Азия и Европа, а в Северна Америка нематода унищожава въведените видове бор1,2. Упадъкът на боровата дървесина е основен икономически проблем и перспективата за глобалното му разпространение е тревожна3. Следните видове бор са най-често нападнати от нематода: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Боровата нематода е сериозно заболяване, което може да убие боровите дървета в рамките на седмици или месеци след заразяването. В допълнение, огнищата на борови нематоди са често срещани в различни екосистеми, така че са установени устойчиви вериги на инфекция1.
Bursaphelenchus xylophilus е карантинен растително-паразитен нематод, принадлежащ към суперсемейство Aphelenchoidea и клад 102.5. Нематода се храни с гъбички и се възпроизвежда в дървесните тъкани на борови дървета, развивайки се в четири различни ларвни стадии: L1, L2, L3, L4 и възрастен индивид1,6. В условията на недостиг на храна боровата нематода преминава в специализиран ларвен стадий – дауер, който паразитира върху своя вектор – боровия корояд (Monochamus alternatus) и се пренася върху здрави борови дървета. При здрави гостоприемници нематодите бързо мигрират през растителните тъкани и се хранят с паренхиматозни клетки, което води до редица реакции на свръхчувствителност, увяхване на бора и смърт в рамките на една година след заразяването1,7,8.
Биологичният контрол на борови нематоди отдавна е предизвикателство, като карантинните мерки датират от 20-ти век. Настоящите стратегии за контролиране на борови нематоди включват предимно химически обработки, включително фумигация на дърво и имплантиране на нематоциди в стволовете на дърветата. Най-често използваните нематоциди са авермектин и авермектин бензоат, които принадлежат към семейството на авермектините. Тези скъпи химикали са много ефективни срещу много видове нематоди и се считат за безопасни за околната среда9. Въпреки това, многократната употреба на тези нематоциди се очаква да създаде натиск за селекция, който почти сигурно ще доведе до появата на резистентни борови нематоди, както беше демонстрирано за няколко насекоми вредители, като Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella и нематодите Trichostrongylus colubriformis и Ostertagia circumcincta, които постепенно са развили устойчивост към авермектини 10,11,12. Следователно моделите на резистентност трябва редовно да се изследват и нематицидите да се проверяват непрекъснато, за да се намерят алтернативни, рентабилни и щадящи околната среда мерки за контрол на PVD. През последните десетилетия редица автори предложиха използването на растителни екстракти, етерични масла и летливи вещества като агенти за контрол на нематоди 13,14,15,16.
Наскоро демонстрирахме нематицидната активност на индол, междуклетъчна и междуцарствена сигнална молекула, в Caenorhabditis elegans 17 . Индолът е широко разпространен вътреклетъчен сигнал в микробната екология, контролиращ многобройни функции, които засягат микробната физиология, образуването на спори, стабилността на плазмида, резистентността към лекарства, образуването на биофилм и вирулентността 18, 19. Активността на индола и неговите производни срещу други патогенни нематоди не е проучена. В това проучване ние изследвахме нематоцидната активност на 34 индола срещу борови нематоди и изяснихме механизма на действие на най-мощния 5-йодоиндол с помощта на микроскопия, фотография с интервал от време и експерименти с молекулярно докингване и оценихме токсичните му ефекти върху растенията с помощта на анализ на покълването на семена.
По-рано се съобщава, че високи концентрации (>1,0 mM) на индол имат нематоциден ефект върху нематодите17. След третиране на B. xylophilus (смесени етапи на живот) с индол или 33 различни индолови производни при 1 тМ, смъртността на B. xylophilus се измерва чрез преброяване на живи и мъртви нематоди в контролната и третираната групи. Пет индола показват значителна нематоцидна активност; преживяемостта на нетретираната контролна група е 95 ± 7% след 24 часа. От 34 тествани индола, 5-йодоиндол и 4-флуороиндол при 1 mM причиняват 100% смъртност, докато 5,6-дифлуороиндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-йодоиндол причиняват приблизително 50% смъртност (Таблица 1).
Ефект на 5-йодоиндол върху образуването на вакуоли и метаболизма на нематода от борова дървесина. (A) Ефект на авермектин и 5-йодоиндол върху възрастни мъжки нематоди, (B) L1 стадий на нематодни яйца и (C) метаболизъм на B. xylophilus, (i) вакуоли не са наблюдавани на 0 h, лечението е довело до (ii) вакуоли, (iii) натрупване на множество вакуоли, (iv) подуване на вакуоли, (v) сливане на вакуоли и (vi) образуване на гигантски вакуоли. Червените стрелки показват подуване на вакуоли, сините стрелки показват сливане на вакуоли, а черните стрелки показват гигантски вакуоли. Скала = 50 μm.
В допълнение, това проучване също така описва последователния процес на индуцирана от метан смърт при борови нематоди (Фигура 4C). Метаногенната смърт е неапоптотичен тип клетъчна смърт, свързана с натрупването на видни цитоплазмени вакуоли27. Морфологичните дефекти, наблюдавани при борови нематоди, изглежда са тясно свързани с механизма на смърт, предизвикана от метан. Микроскопското изследване в различно време показва, че гигантски вакуоли се образуват след 20 часа излагане на 5-йодоиндол (0,1 mM). Микроскопични вакуоли се наблюдават след 8 часа от лечението и броят им се увеличава след 12 часа. Няколко големи вакуоли се наблюдават след 14 часа. Няколко слети вакуоли бяха ясно видими след 12-16 часа лечение, което показва, че сливането на вакуоли е в основата на механизма на метаногенна смърт. След 20 часа в червея бяха открити няколко гигантски вакуоли. Тези наблюдения представляват първия доклад за метуоза при C. elegans.
При червеи, третирани с 5-йодоиндол, също се наблюдава агрегация и разкъсване на вакуола (фиг. 5), както се вижда от огъване на червея и освобождаване на вакуола в околната среда. Разрушаване на вакуола също се наблюдава в мембраната на черупката на яйцата, която обикновено се запазва непокътната от L2 по време на излюпване (допълнителна фигура S2). Тези наблюдения подкрепят участието на натрупване на течност и недостатъчност на осморегулацията, както и обратимо клетъчно увреждане (RCI), в процеса на образуване на вакуоли и нагнояване (фиг. 5).
Хипотезирайки ролята на йода в наблюдаваното образуване на вакуоли, ние изследвахме нематицидната активност на натриевия йодид (NaI) и калиевия йодид (KI). Въпреки това, при концентрации (0.1, 0.5 или 1 mM), те не повлияват нито оцеляването на нематоди, нито образуването на вакуоли (допълнителна фигура S5), въпреки че 1 mM KI има лек нематоциден ефект. От друга страна, 7-йодоиндол (1 или 2 тМ), като 5-йодоиндол, индуцира множество вакуоли и структурни деформации (допълнителна фигура S6). Двата йодоиндола показват сходни фенотипни характеристики в борови нематоди, докато NaI и KI не. Интересно е, че индолът не индуцира образуване на вакуоли в B. xylophilus при тестваните концентрации (данните не са показани). По този начин резултатите потвърдиха, че индол-йодният комплекс е отговорен за вакуолизацията и метаболизма на B. xylophilus.
Сред индолите, тествани за нематоцидна активност, 5-йодоиндолът има най-висок индекс на приплъзване от -5,89 kcal/mol, следван от 7-йодоиндол (-4,48 kcal/mol), 4-флуороиндол (-4,33) и индол (-4,03) (Фигура 6). Силната скелетна водородна връзка на 5-йодоиндол с левцин 218 стабилизира свързването му, докато всички други индолови производни се свързват със серин 260 чрез странични верижни водородни връзки. Сред другите моделирани йодоиндоли, 2-йодоиндолът има стойност на свързване от -5,248 kcal/mol, което се дължи на основната му водородна връзка с левцин 218. Други известни свързвания включват 3-йодоиндол (-4,3 kcal/mol), 4-йодоиндол (-4,0 kcal/mol) и 6-флуороиндол (-2,6 kcal/mol) (допълнителна фигура S8). Повечето халогенирани индоли и самият индол, с изключение на 5-йодоиндол и 2-йодоиндол, образуват връзка със серин 260. Фактът, че водородната връзка с левцин 218 е показател за ефективно свързване на рецептор-лиганд, както се наблюдава за ивермектин (допълнителна фигура S7), потвърждава, че 5-йодоиндолът и 2-йодоиндолът, подобно на ивермектин, се свързва здраво с активното място на GluCL рецептора чрез левцин 218 (фиг. 6 и допълнителна фигура S8). Ние предлагаме, че това свързване е необходимо за поддържане на структурата на отворените пори на GluCL комплекса и че чрез плътно свързване към активното място на GluCL рецептора, 5-йодоиндол, 2-йодоиндол, авермектин и ивермектин по този начин поддържат йонния канал отворен и позволяват поемането на течности.
Молекулярно свързване на индол и халогениран индол към GluCL. Ориентации на свързване на (A) индол, (B) 4-флуороиндол, (C) 7-йодоиндол и (D) 5-йодоиндол лиганди към активното място на GluCL. Протеинът е представен с лента, а гръбначните водородни връзки са показани като жълти пунктирани линии. (A'), (B'), (C') и (D') показват взаимодействията на съответните лиганди с околните аминокиселинни остатъци, а водородните връзки на страничната верига са обозначени с розови пунктирани стрелки.
Бяха проведени експерименти за оценка на токсичния ефект на 5-йодоиндола върху покълването на семена от зеле и репички. 5-йодоиндол (0,05 или 0,1 mM) или авермектин (10 μg/mL) имат малък или никакъв ефект върху първоначалното покълване и поникването на растенията (Фигура 7). В допълнение, не е открита значителна разлика между степента на покълване на нетретирани контроли и семена, третирани с 5-йодоиндол или авермектин. Ефектът върху удължаването на главния корен и броя на формираните странични корени е незначителен, въпреки че 1 mM (10 пъти неговата активна концентрация) 5-йодоиндол леко забавя развитието на страничните корени. Тези резултати показват, че 5-йодоиндолът е нетоксичен за растителните клетки и не пречи на процесите на развитие на растенията при изследваните концентрации.
Ефект на 5-йодоиндол върху покълването на семената. Покълване, поникване и странично вкореняване на семена от B. oleracea и R. raphanistrum върху агарна среда Murashige и Skoog с или без авермектин или 5-йодоиндол. Покълването се записва след 3 дни инкубиране при 22°C.
Това проучване съобщава за няколко случая на убиване на нематоди от индоли. Важно е, че това е първият доклад за йодоиндол, предизвикващ метилиране (процес, причинен от натрупването на малки вакуоли, които постепенно се сливат в гигантски вакуоли, в крайна сметка водещи до разкъсване на мембраната и смърт) в борови иглички, като йодоиндолът проявява значителни нематоцидни свойства, подобни на тези на търговския нематоцид авермектин.
По-рано се съобщава, че индолите упражняват множество сигнални функции в прокариоти и еукариоти, включително инхибиране/образуване на биофилм, бактериално оцеляване и патогенност19,32,33,34. Напоследък потенциалните терапевтични ефекти на халогенирани индоли, индолови алкалоиди и полусинтетични индолови производни привлякоха обширен изследователски интерес35,36,37. Например, доказано е, че халогенираните индоли убиват устойчиви клетки на Escherichia coli и Staphylococcus aureus37. В допълнение, от научен интерес е да се изследва ефикасността на халогенираните индоли срещу други видове, родове и царства и това изследване е стъпка към постигането на тази цел.
Тук предлагаме механизъм за индуцирана от 5-йодоиндол смъртност в C. elegans въз основа на обратимо клетъчно увреждане (RCI) и метилиране (фигури 4C и 5). Едематозни промени като подпухналост и вакуолна дегенерация са индикатори за RCI и метилиране, проявяващи се като гигантски вакуоли в цитоплазмата 48, 49. RCI пречи на производството на енергия чрез намаляване на производството на АТФ, причинявайки повреда на ATPase помпата или разрушаване на клетъчните мембрани и предизвикване на бърз приток на Na+, Ca2+ и вода50,51,52. Интрацитоплазмените вакуоли възникват в животински клетки в резултат на натрупване на течност в цитоплазмата поради притока на Ca2+ и вода53. Интересното е, че този механизъм на клетъчно увреждане е обратим, ако увреждането е временно и клетките започват да произвеждат АТФ за определен период от време, но ако увреждането продължава или се влоши, клетките умират.54 Нашите наблюдения показват, че нематодите, третирани с 5-йодоиндол, не са в състояние да възстановят нормалната биосинтеза след излагане на стресови условия.
Фенотипът на метилиране, индуциран от 5-йодоиндол в B. xylophilus, може да се дължи на наличието на йод и неговото молекулярно разпределение, тъй като 7-йодоиндолът има по-малък инхибиторен ефект върху B. xylophilus от 5-йодоиндол (Таблица 1 и допълнителна фигура S6). Тези резултати са частично в съответствие с проучванията на Maltese et al. (2014), които съобщават, че транслокацията на пиридиловата азотна част в индола от пара- към мета-позиция премахва вакуолизацията, инхибирането на растежа и цитотоксичността в U251 клетки, което предполага, че взаимодействието на молекулата със специфично активно място в протеина е критично27,44,45. Взаимодействията между индолови или халогенирани индоли и GluCL рецептори, наблюдавани в това проучване, също подкрепят това схващане, тъй като е установено, че 5- и 2-йодоиндолът се свързват с GluCL рецепторите по-силно от другите изследвани индоли (Фигура 6 и допълнителна фигура S8). Установено е, че йодът на втора или пета позиция на индола се свързва с левцин 218 на GluCL рецептора чрез водородни връзки в гръбнака, докато други халогенирани индоли и самият индол образуват слаби водородни връзки в страничната верига със серин 260 (Фигура 6). Следователно ние предполагаме, че локализирането на халогена играе важна роля в индуцирането на вакуолна дегенерация, докато здравото свързване на 5-йодоиндол поддържа йонния канал отворен, като по този начин позволява бърз приток на течност и разкъсване на вакуола. Въпреки това подробният механизъм на действие на 5-йодоиндола остава да бъде определен.
Преди практическото приложение на 5-йодоиндола трябва да се анализира токсичното му действие върху растенията. Нашите експерименти за покълване на семена показаха, че 5-йодоиндолът няма отрицателен ефект върху покълването на семената или последващите процеси на развитие при изследваните концентрации (Фигура 7). По този начин това изследване предоставя основа за използването на 5-йодоиндол в екологичната среда за контрол на вредността на борови нематоди за борови дървета.
Предишни доклади показват, че терапията, базирана на индол, представлява потенциален подход за справяне с проблема с антибиотичната резистентност и прогресията на рака55. В допълнение, индолите притежават антибактериална, противоракова, антиоксидантна, противовъзпалителна, антидиабетна, антивирусна, антипролиферативна и противотуберкулозна активност и могат да служат като обещаваща основа за разработване на лекарства 56, 57. Това проучване предполага за първи път потенциалната употреба на йод като антипаразитен и антихелминтен агент.
Авермектинът е открит преди три десетилетия и спечели Нобелова награда през 2015 г., а употребата му като антихелминтно средство все още активно продължава. Въпреки това, поради бързото развитие на резистентност към авермектини в нематоди и насекоми вредители, е необходима алтернативна, евтина и екологична стратегия за контролиране на инфекцията с боровата борова борова дървесина. Това проучване също така докладва механизма, чрез който 5-йодоиндолът убива борови нематоди и че 5-йодоиндолът има ниска токсичност за растителните клетки, което отваря добри перспективи за бъдещото му търговско приложение.
Всички експерименти бяха одобрени от Комитета по етика на университета Yeungnam, Gyeongsan, Корея, и методите бяха извършени в съответствие с насоките на Комитета по етика на университета Yeungnam.
Експериментите за инкубация на яйца бяха проведени с помощта на установени процедури43. За да се оцени степента на излюпване (HR), 1-дневни възрастни нематоди (приблизително 100 женски и 100 мъжки) се прехвърлят в петриеви панички, съдържащи гъбата, и се оставят да растат в продължение на 24 часа. След това яйцата се изолират и се третират с 5-йодоиндол (0.05 тМ и 0.1 тМ) или авермектин (10 μg/ml) като суспензия в стерилна дестилирана вода. Тези суспензии (500 μl; приблизително 100 яйца) се прехвърлят в ямките на 24-ямкова плака за тъканни култури и се инкубират при 22 °C. Преброяването на L2 се извършва след 24 часа инкубация, но се считат за мъртви, ако клетките не се движат, когато се стимулират с фина платинена жица. Този експеримент беше проведен на два етапа, всеки с шест повторения. Данните от двата експеримента бяха комбинирани и представени. Процентът на HR се изчислява, както следва:
Смъртността на ларвите беше оценена с помощта на предварително разработени процедури. Яйцата на нематоди бяха събрани и ембрионите бяха синхронизирани чрез излюпване в стерилна дестилирана вода, за да се генерират ларви в стадий L2. Синхронизирани ларви (приблизително 500 нематоди) се третират с 5-йодоиндол (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектин (10 μg/ml) и се отглеждат върху B. cinerea Петри плочи. След 48 часа инкубация при 22 ° C, нематодите се събират в стерилна дестилирана вода и се изследват за наличие на етапи L2, L3 и L4. Наличието на етапи L3 и L4 показва трансформация на ларви, докато наличието на етап L2 показва липса на трансформация. Изображенията са получени с помощта на iRiS™ Digital Cell Imaging System. Този експеримент беше проведен на два етапа, всеки с шест повторения. Данните от двата експеримента бяха комбинирани и представени.
Токсичността на 5-йодоиндол и авермектин към семената беше оценена с помощта на тестове за покълване върху плочи с агар Murashige и Skoog.62 Семената на B. oleracea и R. raphanistrum бяха първо накиснати в стерилна дестилирана вода за един ден, промити с 1 ml 100% етанол, стерилизирани с 1 ml 50% търговска белина (3% натриев хипохлорит) за 15 минути и се промива пет пъти с 1 ml стерилна вода. След това стерилизираните семена се пресоват върху плаки с агар за покълване, съдържащи 0.86 g/l (0.2X) среда Murashige и Skoog и 0.7% бактериологичен агар с или без 5-йодоиндол или авермектин. След това плаките се инкубират при 22 °C и се правят изображения след 3 дни инкубиране. Този експеримент беше проведен на два етапа, всеки от които имаше шест повторения.
Време на публикуване: 26 февруари 2025 г