Боровият нематод е карантинен мигриращ ендопаразит, за който е известно, че причинява сериозни икономически загуби в екосистемите на боровите гори. Настоящото проучване разглежда нематоцидната активност на халогенираните индоли срещу борови нематоди и техния механизъм на действие. Нематоцидната активност на 5-йодоиндол и авермектин (положителна контрола) срещу борови нематоди е сходна и висока при ниски концентрации (10 μg/mL). 5-йодоиндол намалява плодовитостта, репродуктивната активност, ембрионалната и ларвната смъртност и двигателното поведение. Молекулярните взаимодействия на лиганди със специфични за безгръбначните глутамат-зависими хлоридни канални рецептори подкрепят идеята, че 5-йодоиндолът, подобно на авермектина, се свързва здраво с активния център на рецептора. 5-йодоиндолът също така индуцира различни фенотипни деформации в нематодите, включително анормален колапс/свиване на органи и повишена вакуолизация. Тези резултати показват, че вакуолите могат да играят роля в смъртта, медиирана от метилиране на нематодите. Важно е, че 5-йодоиндолът е нетоксичен и за двата растителни вида (зеле и репички). Следователно, това проучване показва, че приложението на йодоиндол при условия на околната среда може да контролира увреждането от увяхване на боровете.
Боровият нематод (Bursaphelenchus xylophilus) принадлежи към боровите дървесни нематоди (PWN), мигриращи ендопаразитни нематоди, за които е известно, че причиняват сериозни екологични щети на боровите гори1. Болестта по увяхване на боровете (PWD), причинена от боровия нематод, се превръща в сериозен проблем на няколко континента, включително Азия и Европа, а в Северна Америка нематодът унищожава интродуцирани видове борови1,2. Упадъкът на боровите дървета е основен икономически проблем и перспективата за глобалното му разпространение е тревожна3. Следните видове борови дървета са най-често атакувани от нематода: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Боровият нематод е сериозно заболяване, което може да убие борови дървета в рамките на седмици или месеци след заразяването. Освен това, огнищата на борови нематоди са често срещани в различни екосистеми, така че са установени устойчиви вериги на инфекция1.
Bursaphelenchus xylophilus е карантинен растителен паразитен нематод, принадлежащ към суперсемейство Aphelenchoidea и клад 102.5. Нематодът се храни с гъби и се размножава в дървесните тъкани на боровите дървета, като се развива в четири различни ларвни стадия: L1, L2, L3, L4 и възрастен индивид1,6. При условия на недостиг на храна, боровият нематод преминава в специализиран ларвен стадий – дауер, който паразитира върху своя вектор – боровия корояд (Monochamus alternatus) и се пренася върху здрави борови дървета. В здравите гостоприемници нематодите бързо мигрират през растителните тъкани и се хранят с паренхимни клетки, което води до редица реакции на свръхчувствителност, увяхване на бора и смърт в рамките на една година след заразяването1,7,8.
Биологичният контрол на боровите нематоди отдавна е предизвикателство, като карантинните мерки датират от 20-ти век. Съвременните стратегии за борба с боровите нематоди включват предимно химични обработки, включително фумигация на дървесината и имплантиране на нематициди в стволовете на дърветата. Най-често използваните нематициди са авермектин и авермектин бензоат, които принадлежат към семейството на авермектините. Тези скъпи химикали са високоефективни срещу много видове нематоди и се считат за безопасни за околната среда9. Очаква се обаче многократната употреба на тези нематициди да създаде селекционен натиск, който почти сигурно ще доведе до появата на резистентни борови нематоди, както е доказано за няколко насекоми вредители, като Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella и нематодите Trichostrongylus colubriformis и Ostertagia circumcincta, които постепенно са развили резистентност към авермектини10,11,12. Следователно, моделите на резистентност трябва редовно да се изучават, а нематицидите да се проверяват непрекъснато, за да се намерят алтернативни, икономически ефективни и екологични мерки за контрол на PVD. През последните десетилетия редица автори предлагат използването на растителни екстракти, етерични масла и летливи вещества като средства за борба с нематоди13,14,15,16.
Наскоро демонстрирахме нематицидната активност на индола, междуклетъчна и междуцарствена сигнализираща молекула, в Caenorhabditis elegans 17. Индолът е широко разпространен вътреклетъчен сигнал в микробната екология, контролиращ множество функции, които влияят върху микробната физиология, образуването на спори, плазмидната стабилност, лекарствената резистентност, образуването на биофилм и вирулентността 18, 19. Активността на индола и неговите производни срещу други патогенни нематоди не е изследвана. В това проучване изследвахме нематицидната активност на 34 индола срещу борови нематоди и изяснихме механизма на действие на най-мощния 5-йодоиндол, използвайки микроскопия, time-lapse фотография и експерименти с молекулярен докинг, и оценихме токсичните му ефекти върху растенията, използвайки анализ на покълването на семената.
Високи концентрации (>1,0 mM) индол са били докладвани преди това, че имат нематоциден ефект върху нематодите17. След третиране на B. xylophilus (смесени жизнени стадии) с индол или 33 различни индолови производни при 1 mM, смъртността на B. xylophilus е измерена чрез преброяване на живи и мъртви нематоди в контролната и третираната група. Пет индола показват значителна нематоцидна активност; преживяемостта на нетретираната контролна група е 95 ± 7% след 24 часа. От 34-те тествани индола, 5-йодоиндол и 4-флуороиндол при 1 mM причиняват 100% смъртност, докато 5,6-дифлуороиндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-йодоиндол причиняват приблизително 50% смъртност (Таблица 1).
Влияние на 5-йодоиндол върху образуването на вакуоли и метаболизма на боровия нематод. (A) Влияние на авермектин и 5-йодоиндол върху възрастни мъжки нематоди, (B) яйца на нематоди в стадий L1 и (C) метаболизъм на B. xylophilus, (i) вакуоли не са наблюдавани на 0 часа, третирането е довело до (ii) вакуоли, (iii) натрупване на множество вакуоли, (iv) подуване на вакуоли, (v) сливане на вакуоли и (vi) образуване на гигантски вакуоли. Червените стрелки показват подуване на вакуолите, сините стрелки показват сливане на вакуоли, а черните стрелки показват гигантски вакуоли. Мащабна лента = 50 μm.
В допълнение, това проучване описва и последователния процес на метан-индуцирана смърт при боровите нематоди (Фигура 4C). Метаногенната смърт е неапоптотичен тип клетъчна смърт, свързана с натрупването на видни цитоплазмени вакуоли27. Морфологичните дефекти, наблюдавани при боровите нематоди, изглежда са тясно свързани с механизма на метан-индуцираната смърт. Микроскопското изследване в различно време показа, че гигантски вакуоли са се образували след 20 часа излагане на 5-йодоиндол (0,1 mM). Микроскопски вакуоли са наблюдавани след 8 часа третиране, а броят им се е увеличил след 12 часа. Няколко големи вакуоли са наблюдавани след 14 часа. Няколко слети вакуоли са ясно видими след 12–16 часа третиране, което показва, че сливането на вакуоли е в основата на механизма на метаногенната смърт. След 20 часа са открити няколко гигантски вакуоли в целия червей. Тези наблюдения представляват първия доклад за метуоза при C. elegans.
При червеи, третирани с 5-йодоиндол, също са наблюдавани агрегация и разкъсване на вакуолите (фиг. 5), както се вижда от огъването на червеите и освобождаването на вакуолите в околната среда. Разрушаване на вакуолите е наблюдавано и в мембраната на яйчената черупка, която обикновено се запазва непокътната от L2 по време на излюпването (допълнителна фиг. S2). Тези наблюдения подкрепят участието на натрупването на течности и осморегулаторната недостатъчност, както и обратимото клетъчно увреждане (RCI), в процеса на образуване на вакуоли и нагнояване (фиг. 5).
Хипотезирайки ролята на йода в наблюдаваното образуване на вакуоли, изследвахме нематицидната активност на натриевия йодид (NaI) и калиевия йодид (KI). Въпреки това, при концентрации (0,1, 0,5 или 1 mM), те не повлияха нито на оцеляването на нематодите, нито на образуването на вакуоли (Допълнителна фигура S5), въпреки че 1 mM KI имаше лек нематициден ефект. От друга страна, 7-йодоиндол (1 или 2 mM), подобно на 5-йодоиндол, индуцира множество вакуоли и структурни деформации (Допълнителна фигура S6). Двата йодоиндола показаха сходни фенотипни характеристики при боровите нематоди, докато NaI и KI не го направиха. Интересното е, че индолът не индуцира образуване на вакуоли в B. xylophilus при тестваните концентрации (данните не са показани). По този начин резултатите потвърдиха, че индол-йодният комплекс е отговорен за вакуолизацията и метаболизма на B. xylophilus.
Сред индолите, тествани за нематоцидна активност, 5-йодоиндолът има най-висок индекс на приплъзване от -5,89 kcal/mol, следван от 7-йодоиндол (-4,48 kcal/mol), 4-флуороиндол (-4,33) и индол (-4,03) (Фигура 6). Силната водородна връзка в основната верига на 5-йодоиндол с левцин 218 стабилизира неговото свързване, докато всички други индолови производни се свързват със серин 260 чрез водородни връзки в страничната верига. Сред другите моделирани йодоиндоли, 2-йодоиндолът има свързваща стойност от -5,248 kcal/mol, което се дължи на основната му водородна връзка с левцин 218. Други известни свързвания включват 3-йодоиндол (-4,3 kcal/mol), 4-йодоиндол (-4,0 kcal/mol) и 6-флуороиндол (-2,6 kcal/mol) (допълнителна фигура S8). Повечето халогенирани индоли и самият индол, с изключение на 5-йодоиндол и 2-йодоиндол, образуват връзка със серин 260. Фактът, че водородната връзка с левцин 218 е показателна за ефективно свързване рецептор-лиганд, както е наблюдавано за ивермектин (Допълнителна фигура S7), потвърждава, че 5-йодоиндол и 2-йодоиндол, подобно на ивермектин, се свързват здраво с активния център на GluCL рецептора чрез левцин 218 (Фиг. 6 и Допълнителна фигура S8). Предполагаме, че това свързване е необходимо за поддържане на отворената пореста структура на GluCL комплекса и че чрез здраво свързване с активния център на GluCL рецептора, 5-йодоиндол, 2-йодоиндол, авермектин и ивермектин по този начин поддържат йонния канал отворен и позволяват усвояването на течности.
Молекулярно докинг на индол и халогениран индол към GluCL. Ориентации на свързване на (A) индолови, (B) 4-флуороиндолови, (C) 7-йодоиндолови и (D) 5-йодоиндолови лиганди към активния център на GluCL. Протеинът е представен с лента, а водородните връзки в гръбначната верига са показани като жълти пунктирани линии. (A′), (B′), (C′) и (D′) показват взаимодействията на съответните лиганди с околните аминокиселинни остатъци, а водородните връзки в страничните вериги са обозначени с розови пунктирани стрелки.
Проведени са експерименти за оценка на токсичния ефект на 5-йодоиндол върху покълването на семена от зеле и репички. 5-йодоиндол (0,05 или 0,1 mM) или авермектин (10 μg/mL) имат малък или никакъв ефект върху първоначалното покълване и поникването на растенията (Фигура 7). Освен това не е установена значителна разлика между степента на покълване на нетретирани контроли и семена, третирани с 5-йодоиндол или авермектин. Ефектът върху удължаването на главния корен и броя на образуваните странични корени е незначителен, въпреки че 1 mM (10 пъти активната му концентрация) 5-йодоиндол леко забавя развитието на страничните корени. Тези резултати показват, че 5-йодоиндолът е нетоксичен за растителните клетки и не пречи на процесите на развитие на растенията при изследваните концентрации.
Влияние на 5-йодоиндол върху кълняемостта на семената. Покълване, поникване и странично вкореняване на семена от B. oleracea и R. raphanistrum върху агарова среда Murashige и Skoog със или без авермектин или 5-йодоиндол. Кълняемостта е регистрирана след 3 дни инкубация при 22°C.
Това проучване съобщава за няколко случая на убиване на нематоди от индоли. Важно е да се отбележи, че това е първият доклад за йодоиндол, индуциращ метилиране (процес, причинен от натрупването на малки вакуоли, които постепенно се сливат в гигантски вакуоли, което в крайна сметка води до разкъсване на мембраната и смърт) в борови иглички, като йодоиндолът проявява значителни нематоцидни свойства, подобни на тези на търговския нематоцид авермектин.
Преди това е съобщавано, че индолите упражняват множество сигнални функции в прокариотите и еукариотите, включително инхибиране/образуване на биофилм, бактериално оцеляване и патогенност19,32,33,34. Наскоро потенциалните терапевтични ефекти на халогенираните индоли, индолови алкалоиди и полусинтетични индолови производни привлякоха широк изследователски интерес35,36,37. Например, е доказано, че халогенираните индоли убиват персистиращи клетки на Escherichia coli и Staphylococcus aureus37. Освен това е от научен интерес да се проучи ефикасността на халогенираните индоли срещу други видове, родове и царства и това проучване е стъпка към постигането на тази цел.
Тук предлагаме механизъм за индуцирана от 5-йодоиндол леталност при C. elegans, базиран на обратимо клетъчно увреждане (RCI) и метилиране (Фигури 4C и 5). Едематозни промени като подпухналост и вакуоларна дегенерация са индикатори за RCI и метилиране, проявяващи се като гигантски вакуоли в цитоплазмата48,49. RCI пречи на производството на енергия чрез намаляване на производството на АТФ, причинявайки повреда на АТФазната помпа или разрушаване на клетъчните мембрани и причиняване на бърз приток на Na+, Ca2+ и вода50,51,52. Интрацитоплазмените вакуоли възникват в животинските клетки в резултат на натрупване на течност в цитоплазмата поради притока на Ca2+ и вода53. Интересното е, че този механизъм на клетъчно увреждане е обратим, ако увреждането е временно и клетките започнат да произвеждат АТФ за определен период от време, но ако увреждането продължи или се влоши, клетките умират.54 Нашите наблюдения показват, че нематодите, третирани с 5-йодоиндол, не са в състояние да възстановят нормалната биосинтеза след излагане на стресови условия.
Метилационният фенотип, индуциран от 5-йодоиндол в B. xylophilus, може да се дължи на наличието на йод и неговото молекулно разпределение, тъй като 7-йодоиндолът има по-малък инхибиращ ефект върху B. xylophilus, отколкото 5-йодоиндолът (Таблица 1 и Допълнителна фигура S6). Тези резултати са частично съвместими с проучванията на Maltese et al. (2014), които съобщават, че транслокацията на пиридиловата азотна част в индола от пара- към мета-позиция премахва вакуолизацията, инхибирането на растежа и цитотоксичността в U251 клетки, което предполага, че взаимодействието на молекулата със специфичен активен център в протеина е критично27,44,45. Взаимодействията между индол или халогенирани индоли и GluCL рецептори, наблюдавани в това проучване, също подкрепят това схващане, тъй като е установено, че 5- и 2-йодоиндолът се свързват с GluCL рецепторите по-силно от другите изследвани индоли (Фигура 6 и Допълнителна фигура S8). Установено е, че йодът на втора или пета позиция на индола се свързва с левцин 218 на GluCL рецептора чрез водородни връзки в гръбначната верига, докато други халогенирани индоли и самият индол образуват слаби водородни връзки в страничните вериги със серин 260 (Фигура 6). Следователно предполагаме, че локализацията на халогена играе важна роля в индуцирането на вакуолна дегенерация, докато здравото свързване на 5-йодоиндола поддържа йонния канал отворен, като по този начин позволява бърз приток на течности и разкъсване на вакуолите. Подробният механизъм на действие на 5-йодоиндола обаче остава да бъде определен.
Преди практическото приложение на 5-йодоиндол, е необходимо да се анализира неговият токсичен ефект върху растенията. Нашите експерименти за покълване на семена показаха, че 5-йодоиндолът не е оказал отрицателен ефект върху покълването на семената или последващите процеси на развитие при изследваните концентрации (Фигура 7). По този начин, това проучване предоставя основа за използването на 5-йодоиндол в екологичната среда за контрол на вредността на боровите нематоди по боровите дървета.
Предишни доклади показват, че терапията на базата на индол представлява потенциален подход за справяне с проблема с антибиотичната резистентност и прогресията на рака55. Освен това, индолите притежават антибактериална, противоракова, антиоксидантна, противовъзпалителна, антидиабетна, антивирусна, антипролиферативна и противотуберкулозна активност и могат да послужат като обещаваща основа за разработване на лекарства56,57. Това проучване за първи път предлага потенциалната употреба на йод като антипаразитно и антихелминтно средство.
Авермектинът е открит преди три десетилетия и е удостоен с Нобелова награда през 2015 г., а употребата му като антихелминтик все още активно продължава. Въпреки това, поради бързото развитие на резистентност към авермектини при нематоди и насекоми вредители, е необходима алтернативна, нискобюджетна и екологична стратегия за контрол на инфекцията с боровата берберска болест (PWN) при боровите дървета. Това проучване също така докладва механизма, чрез който 5-йодоиндолът убива боровите нематоди, и че 5-йодоиндолът има ниска токсичност за растителните клетки, което открива добри перспективи за бъдещото му търговско приложение.
Всички експерименти бяха одобрени от Етичната комисия на университета Йонгнам, Кьонсан, Корея, а методите бяха проведени в съответствие с насоките на Етичната комисия на университета Йонгнам.
Експериментите с инкубация на яйца бяха проведени по установени процедури43. За да се оцени степента на излюпване (HR), еднодневни възрастни нематоди (приблизително 100 женски и 100 мъжки) бяха прехвърлени в петриеви панички, съдържащи гъбата, и оставени да растат 24 часа. След това яйцата бяха изолирани и третирани с 5-йодоиндол (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектин (10 μg/ml) като суспензия в стерилна дестилирана вода. Тези суспензии (500 μl; приблизително 100 яйца) бяха прехвърлени в ямките на 24-ямкова плака за тъканни култури и инкубирани при 22 °C. L2 броя бяха направени след 24 часа инкубация, но бяха считани за мъртви, ако клетките не се движеха при стимулиране с фина платинена тел. Този експеримент беше проведен на два етапа, всеки с шест повторения. Данните от двата експеримента бяха комбинирани и представени. Процентът на HR се изчислява, както следва:
Смъртността на ларвите беше оценена с помощта на предварително разработени процедури. Яйцата на нематодите бяха събрани и ембрионите бяха синхронизирани чрез излюпване в стерилна дестилирана вода, за да се генерират ларви в стадий L2. Синхронизираните ларви (приблизително 500 нематоди) бяха третирани с 5-йодоиндол (0,05 mM и 0,1 mM) или авермектин (10 μg/ml) и отгледани върху петриеви плаки с B. cinerea. След 48 часа инкубация при 22 °C, нематодите бяха събрани в стерилна дестилирана вода и изследвани за наличие на стадии L2, L3 и L4. Наличието на стадии L3 и L4 показва ларвна трансформация, докато наличието на стадий L2 показва липса на трансформация. Изображенията бяха получени с помощта на iRiS™ Digital Cell Imaging System. Този експеримент беше проведен на два етапа, всеки с шест повторения. Данните от двата експеримента бяха комбинирани и представени.
Токсичността на 5-йодоиндол и авермектин върху семената е оценена чрез тестове за покълване върху агарови плаки Murashige и Skoog.62 Семената на B. oleracea и R. raphanistrum първо са накиснати в стерилна дестилирана вода за един ден, измити с 1 ml 100% етанол, стерилизирани с 1 ml 50% търговска белина (3% натриев хипохлорит) за 15 минути и измити пет пъти с 1 ml стерилна вода. След това стерилизираните семена са пресовани върху агарови плаки за покълване, съдържащи 0,86 g/l (0,2X) среда Murashige и Skoog и 0,7% бактериологичен агар със или без 5-йодоиндол или авермектин. След това плаките са инкубирани при 22 °C и са направени изображения след 3 дни инкубация. Този експеримент е проведен на два етапа, всеки от които има шест повторения.
Време на публикуване: 26 февруари 2025 г.