Широкото използване на синтетични пестициди доведе до много проблеми, включително появата на резистентни организми, влошаване на околната среда и вреда за човешкото здраве.Ето защо са спешно необходими нови микробни пестициди, които са безопасни за човешкото здраве и околната среда.В това проучване рамнолипидният биосърфактант, произведен от Enterobacter cloacae SJ2, е използван за оценка на токсичността към ларви на комари (Culex quinquefasciatus) и термити (Odontotermes obesus).Резултатите показват, че има дозозависима смъртност между леченията.Стойността на LC50 (50% летална концентрация) на 48-ия час за биосърфактантите от ларви на термити и комари беше определена с помощта на метод за напасване на нелинейна регресионна крива.Резултатите показват, че 48-часовите стойности на LC50 (95% доверителен интервал) на ларвицидната и антитермитната активност на биосърфактанта са съответно 26,49 mg/L (диапазон 25,40 до 27,57) и 33,43 mg/L (диапазон 31,09 до 35,68).Според хистопатологичното изследване, третирането с биосърфактанти е причинило сериозно увреждане на тъканите на органелите на ларви и термити.Резултатите от това проучване показват, че микробният биосърфактант, произведен от Enterobacter cloacae SJ2, е отличен и потенциално ефективен инструмент за контрол на Cx.quinquefasciatus и O. obesus.
В тропическите страни има голям брой болести, пренасяни от комари1.Значението на болестите, пренасяни от комари, е широко разпространено.Повече от 400 000 души умират от малария всяка година, а някои големи градове преживяват епидемии от сериозни заболявания като денга, жълта треска, чикунгуня и зика. 2 Пренасяните от вектори болести се свързват с една на всеки шест инфекции в света, като комарите причиняват най-много значими случаи3 ,4.Culex, Anopheles и Aedes са трите рода комари, които най-често се свързват с предаване на болести5.Разпространението на треска от денга, инфекция, предавана от комара Aedes aegypti, се увеличи през последното десетилетие и представлява значителна заплаха за общественото здраве4,7,8.Според Световната здравна организация (СЗО) повече от 40% от световното население е изложено на риск от треска от денга, като 50–100 милиона нови случая възникват годишно в повече от 100 страни9,10,11.Треската денга се превърна в основен проблем за общественото здраве, тъй като честотата й се увеличи в световен мащаб12,13,14.Anopheles gambiae, известен като африкански комар Anopheles, е най-важният вектор на човешката малария в тропическите и субтропичните региони15.Вирусът на Западен Нил, енцефалитът на Сейнт Луис, японският енцефалит и вирусните инфекции на коне и птици се предават от комарите Culex, често наричани обикновени домашни комари.Освен това те са преносители на бактериални и паразитни заболявания16.В света има повече от 3000 вида термити и те съществуват от повече от 150 милиона години17.Повечето вредители живеят в почвата и се хранят с дървесина и дървени продукти, съдържащи целулоза.Индийският термит Odontotermes obesus е важен вредител, който причинява сериозни щети на важни култури и дървета в плантации18.В селскостопанските райони нашествията на термити на различни етапи могат да причинят огромни икономически щети на различни култури, дървесни видове и строителни материали.Термитите също могат да причинят здравословни проблеми19.
Въпросът за устойчивостта на микроорганизми и вредители в днешната фармацевтична и селскостопанска сфера е сложен20,21.Следователно и двете компании трябва да търсят нови рентабилни антимикробни средства и безопасни биопестициди.Синтетичните пестициди вече са налични и е доказано, че са инфекциозни и отблъскват нецелевите полезни насекоми22.През последните години изследванията върху биосърфактантите се разшириха поради приложението им в различни индустрии.Биоповърхностноактивните вещества са много полезни и жизненоважни в селското стопанство, ремедиацията на почвата, добива на нефт, отстраняването на бактерии и насекоми и преработката на храни 23, 24.Биоповърхностно активните вещества или микробните повърхностно активни вещества са биоповърхностно активни химикали, произведени от микроорганизми като бактерии, дрожди и гъбички в крайбрежни местообитания и замърсени с нефт райони 25, 26.Химически получените повърхностноактивни вещества и биоповърхностно активните вещества са два вида, които се получават директно от естествената среда27.Различни биосърфактанти се получават от морски местообитания 28, 29.Ето защо учените търсят нови технологии за производство на биосърфактанти на базата на естествени бактерии30,31.Напредъкът в подобни изследвания показва важността на тези биологични съединения за опазването на околната среда32.Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium и тези бактериални родове са добре проучени представители23,33.
Има много видове биосърфактанти с широк спектър от приложения34.Съществено предимство на тези съединения е, че някои от тях имат антибактериална, ларвицидна и инсектицидна активност.Това означава, че те могат да се използват в селскостопанската, химическата, фармацевтичната и козметичната промишленост35,36,37,38.Тъй като биосърфактантите обикновено са биоразградими и полезни за околната среда, те се използват в интегрирани програми за управление на вредителите за защита на културите39.По този начин са получени основни познания за ларвицидната и антитермитната активност на микробните биосърфактанти, произведени от Enterobacter cloacae SJ2.Изследвахме смъртността и хистологичните промени при излагане на различни концентрации на рамнолипидни биосърфактанти.В допълнение, ние оценихме широко използваната компютърна програма за количествена структура-активност (QSAR) Ecological Structure-Activity (ECOSAR), за да определим острата токсичност за микроводорасли, дафния и риба.
В това изследване антитермитната активност (токсичност) на пречистени биоповърхностно активни вещества при различни концентрации, вариращи от 30 до 50 mg/ml (на интервали от 5 mg/ml) е тествана срещу индийски термити, O. obesus и четвърти вид ) Оценете.Ларви от етап Cx.Ларви на комари quinquefasciatus.Концентрации на биосърфактант LC50 за 48 часа срещу O. obesus и Cx.C. solanacearum.Ларвите на комарите бяха идентифицирани с помощта на метод за напасване на нелинейна регресионна крива.Резултатите показват, че смъртността от термити нараства с увеличаване на концентрацията на биосърфактант.Резултатите показват, че биосърфактантът има ларвицидна активност (Фигура 1) и антитермитна активност (Фигура 2), с 48-часови стойности на LC50 (95% CI) от 26,49 mg/L (25,40 до 27,57) и 33,43 mg/L. l (Фиг. 31.09 до 35.68), съответно (Таблица 1).По отношение на острата токсичност (48 часа), биосърфактантът се класифицира като „вреден“ за тестваните организми.Биосърфактантът, произведен в това проучване, показа отлична ларвицидна активност със 100% смъртност в рамките на 24-48 часа след излагане.
Изчислете стойността на LC50 за ларвицидна активност.Напасване на кривата на нелинейна регресия (плътна линия) и 95% доверителен интервал (защрихована област) за относителна смъртност (%).
Изчислете стойността на LC50 за антитермитна активност.Напасване на кривата на нелинейна регресия (плътна линия) и 95% доверителен интервал (защрихована област) за относителна смъртност (%).
В края на експеримента под микроскоп се наблюдават морфологични промени и аномалии.Морфологични промени се наблюдават в контролната и третираната група при 40x увеличение.Както е показано на фигура 3, увреждане на растежа се наблюдава при повечето ларви, третирани с биосърфактанти.Фигура 3а показва нормален Cx.quinquefasciatus, Фигура 3b показва аномален Cx.Причинява пет ларви на нематоди.
Ефект на сублетални (LC50) дози биосърфактанти върху развитието на ларвите на Culex quinquefasciatus.Изображение със светлинен микроскоп (a) на нормален Cx при 40 × увеличение.quinquefasciatus (b) Абнормен Cx.Причинява пет ларви на нематоди.
В настоящото изследване хистологичното изследване на третираните ларви (Фиг. 4) и термити (Фиг. 5) разкри няколко аномалии, включително намаляване на коремната област и увреждане на мускулите, епителните слоеве и кожата.средно черво.Хистологията разкрива механизма на инхибиторната активност на биосърфактанта, използван в това изследване.
Хистопатология на нормални нетретирани Cx ларви от 4-ти стадий.quinquefasciatus larvae (контрола: (a,b)) и третирани с биосърфактант (третиране: (c,d)).Стрелките показват третирания чревен епител (epi), ядра (n) и мускул (mu).Ширина = 50 µm.
Хистопатология на нормален нелекуван O. obesus (контрола: (a,b)) и третиран с биосърфактант (лечение: (c,d)).Стрелките показват съответно чревен епител (epi) и мускул (mu).Ширина = 50 µm.
В това проучване ECOSAR беше използван за прогнозиране на острата токсичност на рамнолипидните биосърфактантни продукти за първични производители (зелени водорасли), първични потребители (водни бълхи) и вторични потребители (риби).Тази програма използва усъвършенствани количествени модели на съединение структура-активност за оценка на токсичността въз основа на молекулярната структура.Моделът използва софтуер за структура-активност (SAR) за изчисляване на острата и дългосрочната токсичност на веществата за водните видове.По-конкретно, таблица 2 обобщава изчислените средни летални концентрации (LC50) и средните ефективни концентрации (EC50) за няколко вида.Предполагаемата токсичност е категоризирана в четири нива с помощта на Глобалната хармонизирана система за класификация и етикетиране на химикали (Таблица 3).
Контрол на болести, пренасяни от вектори, особено щамове на комари и комари Aedes.Египтяни, сега трудна работа 40,41,42,43,44,45,46.Въпреки че някои химически налични пестициди, като пиретроиди и органофосфати, са донякъде полезни, те представляват значителни рискове за човешкото здраве, включително диабет, репродуктивни разстройства, неврологични разстройства, рак и респираторни заболявания.Освен това с течение на времето тези насекоми могат да станат резистентни към тях13,43,48.По този начин ефективните и щадящи околната среда мерки за биологичен контрол ще станат по-популярен метод за контрол на комарите49,50.Benelli51 предполага, че ранният контрол на векторите на комарите би бил по-ефективен в градските райони, но те не препоръчват използването на ларвициди в селските райони52.Tom et al 53 също предполагат, че контролирането на комарите в техните незрели стадии би било безопасна и проста стратегия, тъй като те са по-чувствителни към контролните агенти 54 .
Производството на биосърфактант от мощен щам (Enterobacter cloacae SJ2) показва постоянна и обещаваща ефикасност.Предишното ни проучване съобщава, че Enterobacter cloacae SJ2 оптимизира производството на биосърфактант, използвайки физикохимични параметри26.Според тяхното проучване оптималните условия за производство на биосърфактант от потенциален изолат на E. cloacae са инкубиране в продължение на 36 часа, разбъркване при 150 rpm, pH 7,5, 37 °C, соленост 1 ppt, 2% глюкоза като източник на въглерод, 1% мая .екстрактът се използва като източник на азот за получаване на 2,61 g/L биосърфактант.В допълнение, биосърфактантите се характеризират с помощта на TLC, FTIR и MALDI-TOF-MS.Това потвърди, че рамнолипидът е биосърфактант.Гликолипидните биосърфактанти са най-интензивно изучаваният клас от други видове биосърфактанти55.Те се състоят от въглехидратни и липидни части, главно вериги на мастни киселини.Сред гликолипидите основните представители са рамнолипид и софоролипид56.Рамнолипидите съдържат две рамнозни части, свързани с моно- или ди-β-хидроксидеканова киселина 57 .Употребата на рамнолипиди в медицинската и фармацевтичната промишленост е добре установена 58, в допълнение към скорошната им употреба като пестициди 59.
Взаимодействието на биосърфактанта с хидрофобната област на дихателния сифон позволява на водата да преминава през неговата устична кухина, като по този начин увеличава контакта на ларвите с водната среда.Наличието на биосърфактанти засяга и трахеята, чиято дължина е близо до повърхността, което улеснява ларвите да изпълзят на повърхността и да дишат.В резултат на това повърхностното напрежение на водата намалява.Тъй като ларвите не могат да се прикрепят към повърхността на водата, те падат на дъното на резервоара, нарушавайки хидростатичното налягане, което води до прекомерен разход на енергия и смърт чрез удавяне38,60.Подобни резултати са получени от Ghribi61, където биосърфактант, произведен от Bacillus subtilis, проявява ларвицидна активност срещу Ephestia kuehniella.По подобен начин ларвицидната активност на Cx.Das и Mukherjee23 също оценяват ефекта на цикличните липопептиди върху ларвите на quinquefasciatus.
Резултатите от това изследване се отнасят до ларвицидната активност на рамнолипидните биосърфактанти срещу Cx.Унищожаването на комари quinquefasciatus е в съответствие с публикуваните по-рано резултати.Използват се например биосърфактанти на базата на сърфактин, произведени от различни бактерии от рода Bacillus.и Pseudomonas spp.Някои ранни доклади64,65,66 съобщават за убиваща ларви активност на липопептидни биосърфактанти от Bacillus subtilis23.Deepali и др.63 установяват, че рамнолипидният биосърфактант, изолиран от Stenotropomonas maltophilia, има мощна ларвицидна активност при концентрация от 10 mg/L.Силва и др.67 съобщават за ларвицидната активност на рамнолипидния биосърфактант срещу Ae при концентрация от 1 g/L.Aedes aegypti.Kanakdande и др.68 съобщават, че липопептидните биосърфактанти, произведени от Bacillus subtilis, причиняват обща смъртност в ларвите на Culex и термити с липофилната фракция на евкалипта.По подобен начин, Masendra et al.69 съобщават за смъртност на работни мравки (Cryptotermes cynocephalus Light.) от 61,7% в липофилните n-хексан и EtOAc фракции на Е. суров екстракт.
Parthipan et al 70 съобщават за инсектицидно използване на липопептидни биосърфактанти, произведени от Bacillus subtilis A1 и Pseudomonas stutzeri NA3 срещу Anopheles Stephensi, вектор на маларийния паразит Plasmodium.Те наблюдават, че ларвите и какавидите оцеляват по-дълго, имат по-кратки периоди на яйцеполагане, стерилни са и имат по-кратък живот, когато са третирани с различни концентрации на биосърфактанти.Наблюдаваните стойности на LC50 на B. subtilis биосърфактант A1 са съответно 3,58, 4,92, 5,37, 7,10 и 7,99 mg/L за различни състояния на ларви (т.е. ларви I, II, III, IV и стадий на какавида).За сравнение, биосърфактантите за ларвни стадии I-IV и стадии на какавида на Pseudomonas stutzeri NA3 са съответно 2,61, 3,68, 4,48, 5,55 и 6,99 mg/L.Смята се, че забавената фенология на оцелелите ларви и какавиди е резултат от значителни физиологични и метаболитни смущения, причинени от третирания с инсектициди71.
Wickerhamomyces anomalus щам CCMA 0358 произвежда биосърфактант със 100% ларвицидна активност срещу комари Aedes.aegypti 24-часов интервал 38 е по-висок от отчетения от Silva et al.Доказано е, че биосърфактант, произведен от Pseudomonas aeruginosa с използване на слънчогледово масло като източник на въглерод, убива 100% от ларвите в рамките на 48 часа 67 .Abinaya et al.72 и Pradhan et al.73 също демонстрират ларвицидните или инсектицидните ефекти на повърхностноактивните вещества, произведени от няколко изолата от рода Bacillus.Публикувано преди това проучване на Senthil-Nathan et al.установиха, че 100% от ларвите на комари, изложени на растителни лагуни, вероятно ще умрат.74.
Оценката на сублеталните ефекти на инсектицидите върху биологията на насекомите е от решаващо значение за интегрираните програми за управление на вредителите, тъй като сублеталните дози/концентрации не убиват насекоми, но могат да намалят популациите на насекоми в бъдещите поколения чрез нарушаване на биологичните характеристики10.Siqueira et al 75 наблюдава пълна ларвицидна активност (100% смъртност) на рамнолипидния биосърфактант (300 mg/ml), когато се тества при различни концентрации, вариращи от 50 до 300 mg/ml.Стадий на ларви на щамове Aedes aegypti.Те анализираха ефектите от времето до смъртта и сублеталните концентрации върху оцеляването на ларвите и плувната активност.В допълнение, те наблюдават намаляване на скоростта на плуване след 24-48 часа излагане на сублетални концентрации на биосърфактант (напр. 50 mg/mL и 100 mg/mL).Смята се, че отровите, които имат обещаващи сублетални роли, са по-ефективни при причиняването на множество щети на откритите вредители76.
Хистологичните наблюдения на нашите резултати показват, че биосърфактантите, произведени от Enterobacter cloacae SJ2, значително променят тъканите на ларвите на комари (Cx. quinquefasciatus) и термити (O. obesus).Подобни аномалии са причинени от препарати от босилково масло в An.gambiaes.s и An.арабика са описани от Ochola77.Kamaraj et al.78 също описват същите морфологични аномалии в An.Ларвите на Стефани бяха изложени на златни наночастици.Vasantha-Srinivasan et al.79 също съобщават, че етеричното масло от овчарска торбичка уврежда сериозно камерата и епителните слоеве на Aedes albopictus.Aedes aegypti.Raghavendran et al съобщават, че ларвите на комарите са третирани с 500 mg/ml мицелен екстракт от местна гъба Penicillium.Ae показват тежко хистологично увреждане.aegypti и Cx.Смъртност 80. Преди това Abinaya et al.Изследвани са ларви от четвърта възраст на An.Стефанси и Ае.aegypti откри многобройни хистологични промени в Aedes aegypti, третирани с екзополизахариди на B. licheniformis, включително стомашен цекум, мускулна атрофия, увреждане и дезорганизация на ганглиите на нервния корд72.Според Raghavendran et al., след третиране с екстракт от мицел на P. daleae, клетките на средното черво на тествани комари (ларви от 4-ти етап) показват подуване на чревния лумен, намаляване на междуклетъчното съдържание и ядрена дегенерация81.Същите хистологични промени се наблюдават при ларви на комари, третирани с екстракт от листа на ехинацея, което показва инсектицидния потенциал на третираните съединения50.
Използването на софтуера ECOSAR получи международно признание82.Настоящите изследвания показват, че острата токсичност на биосърфактантите на ECOSAR за микроводорасли (C. vulgaris), риби и водни бълхи (D. magna) попада в категорията „токсичност“, определена от Обединените нации83.Моделът за екотоксичност ECOSAR използва SAR и QSAR за прогнозиране на остра и дългосрочна токсичност на вещества и често се използва за прогнозиране на токсичността на органични замърсители82,84.
Параформалдехид, натриев фосфатен буфер (pH 7,4) и всички други химикали, използвани в това изследване, са закупени от HiMedia Laboratories, Индия.
Производството на биосърфактант се извършва в 500 ml ерленмайерови колби, съдържащи 200 ml стерилна среда на Bushnell Haas, допълнена с 1% суров петрол като единствен източник на въглерод.Прекултура от Enterobacter cloacae SJ2 (1.4 × 104 CFU/ml) се инокулира и култивира на орбитален шейкър при 37°C, 200 rpm в продължение на 7 дни.След инкубационния период, биосърфактантът се екстрахира чрез центрофугиране на културалната среда при 3400 × g за 20 минути при 4 ° С и полученият супернатант се използва за скринингови цели.Процедурите за оптимизиране и характеризирането на биосърфактантите бяха възприети от нашето по-ранно проучване26.
Ларвите на Culex quinquefasciatus са получени от Центъра за напреднали изследвания в морската биология (CAS), Palanchipetai, Тамил Наду (Индия).Ларвите се отглеждат в пластмасови контейнери, пълни с дейонизирана вода при 27 ± 2°C и фотопериод 12:12 (светлина:тъмно).Ларвите на комарите се хранят с 10% разтвор на глюкоза.
Ларвите на Culex quinquefasciatus са открити в открити и незащитени септични ями.Използвайте стандартни указания за класификация, за да идентифицирате и култивирате ларви в лабораторията85.Проведени са ларвицидни опити в съответствие с препоръките на Световната здравна организация 86 .SH.Ларвите от четвърта възраст на quinquefasciatus се събират в затворени епруветки в групи от 25 ml и 50 ml с въздушна междина от две трети от техния капацитет.Биосърфактант (0–50 mg/ml) се добавя към всяка епруветка поотделно и се съхранява при 25 °C.Контролната епруветка използва само дестилирана вода (50 ml).За мъртви ларви се считат тези, които не показват признаци на плуване по време на инкубационния период (12–48 часа) 87 .Изчислете процента на смъртност на ларвите, като използвате уравнението.(1)88.
Семейството Odontotermitidae включва индийския термит Odontotermes obesus, открит в гниещи трупи в Селскостопанския кампус (Университет Анамалай, Индия).Тествайте този биосърфактант (0–50 mg/ml), като използвате нормални процедури, за да определите дали е вреден.След сушене в ламинарен въздушен поток в продължение на 30 минути, всяка лента от хартия Whatman беше покрита с биосърфактант в концентрация от 30, 40 или 50 mg / ml.Предварително покрити и непокрити хартиени ленти бяха тествани и сравнени в центъра на петриево блюдо.Всяко петриево блюдо съдържа около тридесет активни термити O. obesus.Контролните и тестовите термити получиха мокра хартия като източник на храна.Всички плочи се държат при стайна температура през целия период на инкубация.Термитите умират след 12, 24, 36 и 48 часа89,90.След това уравнение 1 беше използвано за оценка на процента на смъртност на термити при различни концентрации на биосърфактант.(2).
Пробите се държат върху лед и се опаковат в микроепруветки, съдържащи 100 ml 0,1 М натриев фосфатен буфер (рН 7,4) и се изпращат в Централната лаборатория по патология на аквакултурите (CAPL) на Центъра за аквакултури Раджив Ганди (RGCA).Хистологична лаборатория, Sirkali, Mayiladuthurai.Област, Тамил Наду, Индия за допълнителен анализ.Пробите веднага се фиксират в 4% параформалдехид при 37°C за 48 часа.
След фазата на фиксиране, материалът се промива три пъти с 0.1 М натриев фосфатен буфер (рН 7.4), поетапно се дехидратира в етанол и се накисва в смола LEICA за 7 дни.След това субстанцията се поставя в пластмасова форма, пълна със смола и полимеризатор, и след това се поставя в пещ, загрята до 37°C, докато блокът, съдържащ субстанцията, се полимеризира напълно.
След полимеризация, блоковете се нарязват с помощта на микротом LEICA RM2235 (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, САЩ) до дебелина 3 mm.Секциите са групирани на слайдове, с шест секции на слайд.Предметните стъкла се сушат при стайна температура, след това се оцветяват с хематоксилин в продължение на 7 минути и се промиват с течаща вода в продължение на 4 минути.Освен това нанесете разтвора на еозин върху кожата за 5 минути и изплакнете с течаща вода за 5 минути.
Острата токсичност е предвидена с помощта на водни организми от различни тропически нива: 96-часов LC50 за риба, 48-часов LC50 за D. magna и 96-часов EC50 за зелени водорасли.Токсичността на рамнолипидните биосърфактанти за риби и зелени водорасли беше оценена с помощта на софтуера ECOSAR версия 2.2 за Windows, разработен от Агенцията за опазване на околната среда на САЩ.(Достъпно онлайн на https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
Всички тестове за ларвицидна и антитермитна активност бяха проведени в три екземпляра.Беше извършена нелинейна регресия (логаритъм на променливите доза-отговор) на данните за смъртността на ларви и термити, за да се изчисли средната летална концентрация (LC50) с 95% доверителен интервал и кривите на реакцията на концентрация бяха генерирани с помощта на Prism® (версия 8.0, GraphPad Software) Inc., САЩ) 84, 91.
Настоящото проучване разкрива потенциала на микробните биосърфактанти, произведени от Enterobacter cloacae SJ2 като ларвицидни и антитермитни агенти срещу комари, и тази работа ще допринесе за по-доброто разбиране на механизмите на ларвицидно и антитермитно действие.Хистологичните изследвания на ларви, третирани с биосърфактанти, показват увреждане на храносмилателния тракт, средното черво, мозъчната кора и хиперплазия на чревните епителни клетки.Резултати: Токсикологичната оценка на антитермитната и ларвицидната активност на рамнолипидния биосърфактант, произведен от Enterobacter cloacae SJ2, разкри, че този изолат е потенциален биопестицид за контрол на болести, пренасяни от вектори на комари (Cx quinquefasciatus) и термити (O. obesus).Необходимо е да се разбере основната токсичност за околната среда на биосърфактантите и тяхното потенциално въздействие върху околната среда.Това проучване осигурява научна основа за оценка на риска за околната среда от биоповърхностно активните вещества.
Време на публикуване: 9 април 2024 г