Това проучване оценява леталността, сублеталността и токсичността на търговския продуктциперметринформулировки за ануранови попови лъжички. При острия тест концентрации от 100–800 μg/L са тествани за 96 часа. При хроничния тест естествено срещащите се концентрации на циперметрин (1, 3, 6 и 20 μg/L) са тествани за смъртност, последвани от микронуклеусни тестове и ядрени аномалии на червените кръвни клетки в продължение на 7 дни. LC50 на търговския състав на циперметрин за попови лъжички е 273,41 μg L-1. При хроничния тест най-високата концентрация (20 μg L-1) води до повече от 50% смъртност, тъй като убива половината от тестваните попови лъжички. Микронуклеарният тест показа значителни резултати при 6 и 20 μg L-1 и бяха открити няколко ядрени аномалии, което показва, че търговският състав на циперметрин има генотоксичен потенциал срещу P. gracilis. Циперметринът е висок риск за този вид, което показва, че може да причини множество проблеми и да повлияе на динамиката на тази екосистема в краткосрочен и дългосрочен план. Следователно може да се заключи, че търговските формулировки на циперметрин имат токсични ефекти върху P. gracilis.
Поради непрекъснатото разширяване на земеделските дейности и интензивното прилагане наконтрол на вредителитемерки, водните животни често са изложени на пестициди1,2. Замърсяването на водните ресурси в близост до селскостопански полета може да засегне развитието и оцеляването на нецелеви организми като земноводните.
Земноводните стават все по-важни при оценката на екологичните матрици. Анураните се считат за добри биоиндикатори на замърсители на околната среда поради техните уникални характеристики като сложни жизнени цикли, бързи темпове на растеж на ларвите, трофичен статус, пропусклива кожа 10, 11, зависимост от вода за възпроизводство 12 и незащитени яйца 11, 13, 14. Доказано е, че малката водна жаба (Physalaemus gracilis), известна като плачеща жаба, е вид биоиндикатор за замърсяване с пестициди4,5,6,7,15. Видът се среща в стоящи води, защитени зони или зони с променливи местообитания в Аржентина, Уругвай, Парагвай и Бразилия1617 и се счита за стабилен от класификацията на IUCN поради широкото му разпространение и толерантност към различни местообитания18.
Съобщава се за сублетални ефекти при земноводни след излагане на циперметрин, включително поведенчески, морфологични и биохимични промени в попови лъжички23,24,25, променена смъртност и време на метаморфоза, ензимни промени, намален успех на излюпване24,25, хиперактивност26, инхибиране на холинестеразната активност27 и промени в представянето на плуване7,28. Изследванията на генотоксичните ефекти на циперметрин при земноводни обаче са ограничени. Поради това е важно да се оцени чувствителността на видовете ануран към циперметрин.
Замърсяването на околната среда засяга нормалния растеж и развитие на земноводните, но най-сериозният неблагоприятен ефект е генетичното увреждане на ДНК, причинено от излагане на пестициди13. Анализът на морфологията на кръвните клетки е важен биоиндикатор за замърсяване и потенциална токсичност на дадено вещество за диви видове29. Микронуклеарният тест е един от най-често използваните методи за определяне на генотоксичността на химикали в околната среда30. Това е бърз, ефективен и евтин метод, който е добър индикатор за химическо замърсяване на организми като земноводни31,32 и може да предостави информация за излагане на генотоксични замърсители33.
Целта на това проучване беше да се оцени токсичният потенциал на търговските формулировки на циперметрин за малки водни попови лъжички, като се използва микронуклеарен тест и оценка на екологичния риск.
Кумулативна смъртност (%) на попови лъжички P. gracilis, изложени на различни концентрации търговски циперметрин по време на острия период на теста.
Кумулативна смъртност (%) на попови лъжички P. gracilis, изложени на различни концентрации търговски циперметрин по време на хроничен тест.
Наблюдаваната висока смъртност е резултат от генотоксични ефекти при земноводни, изложени на различни концентрации на циперметрин (6 и 20 μg/L), както се вижда от наличието на микроядра (MN) и ядрени аномалии в еритроцитите. Образуването на MN показва грешки в митозата и е свързано с лошо свързване на хромозомите към микротубулите, дефекти в протеиновите комплекси, отговорни за усвояването и транспорта на хромозомите, грешки в хромозомната сегрегация и грешки в възстановяването на увреждане на ДНК 38, 39 и може да бъде свързано с индуциран от пестициди оксидативен стрес 40, 41. Други аномалии са наблюдавани при всички оценени концентрации. Увеличаването на концентрациите на циперметрин увеличава ядрените аномалии в еритроцитите с 5% и 20% съответно при най-ниската (1 μg/L) и най-високата (20 μg/L) дози. Например промените в ДНК на даден вид могат да имат сериозни последици както за краткосрочното, така и за дългосрочното оцеляване, което води до намаляване на популацията, променена репродуктивна годност, инбридинг, загуба на генетично разнообразие и променени скорости на миграция. Всички тези фактори могат да повлияят на оцеляването и поддържането на вида42,43. Образуването на еритроидни аномалии може да показва блок в цитокинезата, водещ до анормално клетъчно делене (двуядрени еритроцити)44,45; многолопастните ядра са издатини на ядрената мембрана с множество лобове46, докато други еритроидни аномалии могат да бъдат свързани с амплификация на ДНК, като ядрени бъбреци/мехурчета47. Наличието на безядрени еритроцити може да показва нарушен транспорт на кислород, особено в замърсена вода48,49. Апоптозата показва клетъчна смърт50.
Други проучвания също демонстрират генотоксичните ефекти на циперметрин. Kabaña et al.51 демонстрира наличието на микроядра и ядрени промени като двуядрени клетки и апоптотични клетки в клетки на Odontophrynus americanus след излагане на високи концентрации на циперметрин (5000 и 10 000 μg L-1) за 96 часа. Индуцираната от циперметрин апоптоза също беше открита в P. biligonigerus52 и Rhinella arenarum53. Тези резултати предполагат, че циперметринът има генотоксичен ефект върху редица водни организми и че анализът на MN и ENA може да бъде индикатор за сублетални ефекти върху земноводните и може да бъде приложим за местни видове и диви популации, изложени на токсични вещества12.
Търговските формулировки на циперметрин представляват висока опасност за околната среда (както остра, така и хронична), като HQ надвишава нивото54 на Агенцията за опазване на околната среда на САЩ (EPA), което може да повлияе неблагоприятно на вида, ако присъства в околната среда. При оценката на хроничния риск NOEC за смъртност е 3 μg L−1, което потвърждава, че концентрациите, открити във водата, могат да представляват риск за вида55. Смъртоносният NOEC за ларвите на R. arenarum, изложени на смес от ендосулфан и циперметрин, е 500 μg L-1 след 168 часа; тази стойност намалява до 0,0005 μg L-1 след 336 часа. Авторите показват, че колкото по-дълго е експозицията, толкова по-ниски са концентрациите, които са вредни за вида. Също така е важно да се подчертае, че стойностите на NOEC са по-високи от тези на P. gracilis при същото време на експозиция, което показва, че отговорът на вида към циперметрин е специфичен за вида. Освен това, по отношение на смъртността, стойността на CHQ на P. gracilis след излагане на циперметрин достига 64,67, което е по-високо от референтната стойност, определена от Агенцията за опазване на околната среда на САЩ54, а стойността на CHQ на ларвите на R. arenarum също е по-висока от тази стойност (CHQ > 388,00 след 336 часа), което показва, че изследваните инсектициди представляват висок риск за няколко видове земноводни. Като се има предвид, че P. gracilis изисква приблизително 30 дни, за да завърши метаморфозата56, може да се заключи, че изследваните концентрации на циперметрин могат да допринесат за намаляване на популацията, като предотвратяват навлизането на инфектираните индивиди във възрастен или репродуктивен стадий в ранна възраст.
При изчислената оценка на риска от микроядра и други ядрени аномалии на еритроцитите, стойностите на CHQ варират от 14,92 до 97,00, което показва, че циперметринът има потенциален генотоксичен риск за P. gracilis дори в естественото му местообитание. Като се вземе предвид смъртността, максималната концентрация на ксенобиотични съединения, поносими за P. gracilis, е 4,24 μg L-1. Въпреки това, концентрации до 1 μg/L също показват генотоксични ефекти. Този факт може да доведе до увеличаване на броя на необичайните индивиди57 и да повлияе на развитието и възпроизводството на видовете в техните местообитания, което води до намаляване на популациите на земноводни.
Търговските формулировки на инсектицида циперметрин показват висока остра и хронична токсичност към P. gracilis. Наблюдавани са по-високи нива на смъртност, вероятно поради токсични ефекти, както се вижда от наличието на микроядра и ядрени аномалии на еритроцитите, особено назъбени ядра, лобовидни ядра и везикуларни ядра. В допълнение, изследваните видове показват повишени рискове за околната среда, както остри, така и хронични. Тези данни, комбинирани с предишни проучвания от нашата изследователска група, показаха, че дори различни търговски формулировки на циперметрин все още причиняват намалена активност на ацетилхолинестеразата (AChE) и бутирилхолинестеразата (BChE) и оксидативен стрес58 и водят до промени в плувната активност и оралните малформации59 в P. gracilis, което показва, че търговските формулировки на циперметрин имат висока летална и сублетална токсичност за това видове. Хартман и др. 60 установяват, че търговските формулировки на циперметрин са най-токсични за P. gracilis и друг вид от същия род (P. cuvieri) в сравнение с девет други пестицида. Това предполага, че законово одобрените концентрации на циперметрин за опазване на околната среда могат да доведат до висока смъртност и дългосрочно намаляване на населението.
Необходими са допълнителни проучвания за оценка на токсичността на пестицида за земноводните, тъй като концентрациите, открити в околната среда, могат да причинят висока смъртност и да представляват потенциален риск за P. gracilis. Изследванията на видовете земноводни трябва да се насърчават, тъй като данните за тези организми са оскъдни, особено за бразилските видове.
Тестът за хронична токсичност продължи 168 часа (7 дни) при статични условия и сублеталните концентрации бяха: 1, 3, 6 и 20 μg ai L-1. И в двата експеримента 10 попови лъжички на третирана група бяха оценени с шест повторения, за общо 60 попови лъжички на концентрация. Междувременно лечението само с вода служи като отрицателна контрола. Всяка експериментална постановка се състои от стерилно стъклено блюдо с капацитет 500 ml и плътност 1 попова лъжица на 50 ml разтвор. Колбата се покрива с полиетиленово фолио, за да се предотврати изпарението, и се аерира непрекъснато.
Водата беше химически анализирана, за да се определят концентрациите на пестициди на 0, 96 и 168 часа. Според Sabin et al. 68 и Martins et al. 69, анализите са извършени в Лабораторията за анализ на пестициди (LARP) на Федералния университет на Санта Мария, използвайки газова хроматография, свързана с тройна квадруполна масова спектрометрия (Varian модел 1200, Пало Алто, Калифорния, САЩ). Количественото определяне на пестициди във вода е показано като допълнителен материал (Таблица SM1).
За микроядрения тест (MNT) и теста за ядрена аномалия на червените кръвни клетки (RNA) бяха анализирани 15 попови лъжички от всяка третирана група. Поповите лъжички бяха анестезирани с 5% лидокаин (50 mg g-170) и кръвни проби бяха събрани чрез сърдечна пункция с помощта на хепаринизирани спринцовки за еднократна употреба. Кръвните петна се приготвят върху стерилни микроскопски предметни стъкла, сушат се на въздух, фиксират се със 100% метанол (4 ° С) за 2 минути и след това се оцветяват с 10% разтвор на Giemsa за 15 минути на тъмно. В края на процеса предметните стъкла се измиват с дестилирана вода, за да се отстрани излишното петно и се сушат при стайна температура.
Най-малко 1000 червени кръвни клетки от всяка попова лъжица бяха анализирани с помощта на 100 × микроскоп с цел 71, за да се определи наличието на MN и ENA. Общо 75 796 червени кръвни клетки от попови лъжички бяха оценени, като се има предвид концентрацията на циперметрин и контролите. Генотоксичността се анализира съгласно метода на Carrasco et al. и Fenech et al.38,72 чрез определяне на честотата на следните ядрени лезии: (1) безядрени клетки: клетки без ядра; (2) апоптотични клетки: ядрена фрагментация, програмирана клетъчна смърт; (3) двуядрени клетки: клетки с две ядра; (4) ядрени пъпки или мехурчета: клетки с ядра с малки издатини на ядрената мембрана, мехурчета, подобни по размер на микроядра; (5) кариолизирани клетки: клетки само с очертанията на ядрото без вътрешен материал; (6) назъбени клетки: клетки с ядра с очевидни пукнатини или вдлъбнатини във формата им, наричани също бъбрековидни ядра; (7) лобулирани клетки: клетки с ядрени издатини, по-големи от гореспоменатите везикули; и (8) микроклетки: клетки с кондензирани ядра и намалена цитоплазма. Промените бяха сравнени с резултатите от отрицателната контрола.
Резултатите от теста за остра токсичност (LC50) бяха анализирани с помощта на софтуер GBasic и метода TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Данните от хроничния тест бяха предварително тествани за нормалност на грешката (Shapiro-Wilks) и хомогенност на дисперсията (Bartlett). Резултатите бяха анализирани с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA). Тестът на Tukey е използван за сравняване на данните помежду им, а тестът на Dunnett е използван за сравняване на данните между лекуваната група и групата с отрицателна контрола.
Данните за LOEC и NOEC бяха анализирани с помощта на теста на Dunnett. Статистическите тестове бяха проведени с помощта на софтуера Statistica 8.0 (StatSoft) с ниво на значимост 95% (p <0.05).
Време на публикуване: 13 март 2025 г