Това проучване оцени смъртността, сублеталността и токсичността на търговскитециперметринФормулации за попови лъжички от безгръбначни. В острия тест са тествани концентрации от 100–800 μg/L в продължение на 96 часа. В хроничния тест са тествани естествено срещащи се концентрации на циперметрин (1, 3, 6 и 20 μg/L) за смъртност, последвано от микронуклеусен тест и ядрени аномалии на червените кръвни клетки в продължение на 7 дни. LC50 на търговската формулировка на циперметрин за попови лъжички е 273,41 μg L−1. В хроничния тест най-високата концентрация (20 μg L−1) е довела до смъртност над 50%, тъй като е убила половината от тестваните попови лъжички. Микронуклеусният тест показа значителни резултати при 6 и 20 μg L−1 и бяха открити няколко ядрени аномалии, което показва, че търговската формулировка на циперметрин има генотоксичен потенциал срещу P. gracilis. Циперметринът е високорисков за този вид, което показва, че може да причини множество проблеми и да повлияе на динамиката на тази екосистема в краткосрочен и дългосрочен план. Следователно може да се заключи, че търговските формулировки на циперметрин имат токсични ефекти върху P. gracilis.
Поради непрекъснатото разширяване на селскостопанските дейности и интензивното прилагане наборба с вредителитемерки, водните животни често са изложени на пестициди1,2. Замърсяването на водните ресурси в близост до земеделски полета може да повлияе на развитието и оцеляването на нецелеви организми, като например земноводни.
Земноводните стават все по-важни при оценката на екологичните матрици. Безхребетните (Anuran) се считат за добри биоиндикатори за замърсители на околната среда поради техните уникални характеристики като сложни жизнени цикли, бързи темпове на растеж на ларвите, трофичен статус, пропусклива кожа10,11, зависимост от вода за размножаване12 и незащитени яйца11,13,14. Малката водна жаба (Physalaemus gracilis), известна още като плачеща жаба, е доказано, че е биоиндикаторен вид за замърсяване с пестициди4,5,6,7,15. Видът се среща в стоящи води, защитени зони или зони с променливо местообитание в Аржентина, Уругвай, Парагвай и Бразилия1617 и се счита за стабилен според класификацията на IUCN поради широкото си разпространение и толерантност към различни местообитания18.
Съобщава се за сублетални ефекти при земноводни след излагане на циперметрин, включително поведенчески, морфологични и биохимични промени в поповите лъжички23,24,25, променена смъртност и време на метаморфоза, ензимни промени, намален успех на излюпване24,25, хиперактивност26, инхибиране на холинестеразната активност27 и промени в плувните способности7,28. Проучванията на генотоксичните ефекти на циперметрина при земноводни обаче са ограничени. Следователно е важно да се оцени чувствителността на безхребетните видове към циперметрин.
Замърсяването на околната среда влияе върху нормалния растеж и развитие на земноводните, но най-сериозният неблагоприятен ефект е генетичното увреждане на ДНК, причинено от експозиция на пестициди13. Анализът на морфологията на кръвните клетки е важен биоиндикатор за замърсяване и потенциална токсичност на дадено вещество за дивите видове29. Микронуклеусният тест е един от най-често използваните методи за определяне на генотоксичността на химикали в околната среда30. Това е бърз, ефективен и евтин метод, който е добър индикатор за химическо замърсяване на организми като земноводни31,32 и може да предостави информация за експозицията на генотоксични замърсители33.
Целта на това проучване беше да се оцени токсичният потенциал на търговските формулировки на циперметрин върху малки водни попови лъжички, използвайки микроядрен тест и оценка на екологичния риск.
Кумулативна смъртност (%) на попови лъжички на P. gracilis, изложени на различни концентрации на търговски циперметрин по време на острия период на теста.
Кумулативна смъртност (%) на попови лъжички на P. gracilis, изложени на различни концентрации на търговски циперметрин по време на хроничен тест.
Наблюдаваната висока смъртност е резултат от генотоксични ефекти при земноводни, изложени на различни концентрации на циперметрин (6 и 20 μg/L), както се вижда от наличието на микроядра (MN) и ядрени аномалии в еритроцитите. Образуването на MN показва грешки в митозата и е свързано с лошо свързване на хромозомите с микротубулите, дефекти в протеиновите комплекси, отговорни за усвояването и транспорта на хромозомите, грешки в сегрегацията на хромозомите и грешки в поправянето на увреждания на ДНК38,39 и може да е свързано с индуциран от пестициди оксидативен стрес40,41. Други аномалии са наблюдавани при всички оценявани концентрации. Увеличаването на концентрациите на циперметрин увеличава ядрените аномалии в еритроцитите съответно с 5% и 20% при най-ниските (1 μg/L) и най-високите (20 μg/L) дози. Например, промените в ДНК на даден вид могат да имат сериозни последици както за краткосрочното, така и за дългосрочното оцеляване, което води до намаляване на популацията, променена репродуктивна годност, инбридинг, загуба на генетично разнообразие и променени скорости на миграция. Всички тези фактори могат да повлияят на оцеляването и поддържането на видовете42,43. Образуването на еритроидни аномалии може да показва блокиране на цитокинезата, което води до анормално клетъчно делене (двуядрени еритроцити)44,45; многоделните ядра са издатини на ядрената мембрана с множество лобове46, докато други еритроидни аномалии могат да бъдат свързани с амплификация на ДНК, като например ядрени бъбреци/мехурчета47. Наличието на безядрени еритроцити може да показва нарушен транспорт на кислород, особено в замърсена вода48,49. Апоптозата показва клетъчна смърт50.
Други проучвания също демонстрират генотоксичните ефекти на циперметрина. Kabaña et al.51 демонстрират наличието на микроядра и ядрени промени, като например двуядрени клетки и апоптотични клетки в клетки на Odontophrynus americanus след излагане на високи концентрации на циперметрин (5000 и 10 000 μg L−1) в продължение на 96 часа. Индуцирана от циперметрин апоптоза е открита и при P. biligonigerus52 и Rhinella arenarum53. Тези резултати показват, че циперметринът има генотоксични ефекти върху редица водни организми и че MN и ENA анализът може да бъде индикатор за сублетални ефекти върху земноводни и може да е приложим за местни видове и диви популации, изложени на токсиканти12.
Търговските формулировки на циперметрин представляват висока опасност за околната среда (както остра, така и хронична), като висококачествените вещества (HQ) надвишават нивото на Агенцията за защита на околната среда на САЩ (EPA)54, което може да повлияе неблагоприятно на вида, ако присъства в околната среда. При оценката на хроничния риск, NOEC за смъртност е 3 μg L−1, което потвърждава, че концентрациите, открити във водата, могат да представляват риск за вида55. Леталната NOEC за ларви на R. arenarum, изложени на смес от ендосулфан и циперметрин, е 500 μg L−1 след 168 часа; тази стойност намалява до 0,0005 μg L−1 след 336 часа. Авторите показват, че колкото по-дълга е експозицията, толкова по-ниски са концентрациите, които са вредни за вида. Важно е също да се подчертае, че стойностите на NOEC са по-високи от тези на P. gracilis при същото време на експозиция, което показва, че видовият отговор на циперметрин е видово специфичен. Освен това, по отношение на смъртността, стойността на CHQ на P. gracilis след излагане на циперметрин достигна 64,67, което е по-високо от референтната стойност, определена от Агенцията за защита на околната среда на САЩ54, а стойността на CHQ на ларвите на R. arenarum също беше по-висока от тази стойност (CHQ > 388,00 след 336 часа), което показва, че изследваните инсектициди представляват висок риск за няколко вида земноводни. Като се има предвид, че P. gracilis се нуждае от приблизително 30 дни, за да завърши метаморфозата56, може да се заключи, че изследваните концентрации на циперметрин могат да допринесат за намаляване на популацията, като предотвратяват навлизането на заразените индивиди във възрастен или репродуктивен стадий в ранна възраст.
При изчислената оценка на риска от микроядра и други ядрени аномалии на еритроцитите, стойностите на CHQ варират от 14,92 до 97,00, което показва, че циперметринът има потенциален генотоксичен риск за P. gracilis дори в естественото му местообитание. Като се вземе предвид смъртността, максималната концентрация на ксенобиотични съединения, поносима за P. gracilis, е 4,24 μg L−1. Въпреки това, концентрации от едва 1 μg/L също показват генотоксичен ефект. Този факт може да доведе до увеличаване на броя на анормалните индивиди57 и да повлияе на развитието и размножаването на видовете в техните местообитания, което води до намаляване на популациите на земноводни.
Търговските формулировки на инсектицида циперметрин показват висока остра и хронична токсичност за P. gracilis. Наблюдавани са по-високи нива на смъртност, вероятно поради токсични ефекти, както се вижда от наличието на микроядра и ядрени аномалии в еритроцитите, особено назъбени ядра, лобовидни ядра и везикуларни ядра. Освен това, изследваните видове показват повишени рискове за околната среда, както остри, така и хронични. Тези данни, комбинирани с предишни проучвания на нашата изследователска група, показват, че дори различни търговски формулировки на циперметрин все още причиняват намалена активност на ацетилхолинестераза (AChE) и бутирилхолинестераза (BChE) и оксидативен стрес58, и водят до промени в плувната активност и орални малформации59 при P. gracilis, което показва, че търговските формулировки на циперметрин имат висока летална и сублетална токсичност за този вид. Hartmann et al.60 установяват, че търговските формулировки на циперметрин са най-токсични за P. gracilis и друг вид от същия род (P. cuvieri) в сравнение с девет други пестицида. Това предполага, че законно одобрените концентрации на циперметрин за опазване на околната среда могат да доведат до висока смъртност и дългосрочен спад на популацията.
Необходими са допълнителни проучвания, за да се оцени токсичността на пестицида за земноводните, тъй като концентрациите, открити в околната среда, могат да причинят висока смъртност и да представляват потенциален риск за P. gracilis. Изследванията върху видове земноводни трябва да се насърчават, тъй като данните за тези организми са оскъдни, особено за бразилските видове.
Тестът за хронична токсичност е продължил 168 часа (7 дни) при статични условия, а сублеталните концентрации са били: 1, 3, 6 и 20 μg ai L−1. И в двата експеримента са били оценени по 10 попови лъжички на третирана група с шест повторения, за общо 60 попови лъжички на концентрация. Междувременно, третирането само с вода е служило като отрицателна контрола. Всяка експериментална установка се е състоела от стерилна стъклена чиния с вместимост 500 ml и плътност от 1 попова лъжичка на 50 ml разтвор. Колбата е била покрита с полиетиленово фолио, за да се предотврати изпаряването, и е била непрекъснато аерирана.
Водата беше анализирана химически, за да се определят концентрациите на пестициди на 0, 96 и 168 часа. Според Sabin et al.68 и Martins et al.69, анализите са извършени в Лабораторията за анализ на пестициди (LARP) на Федералния университет на Санта Мария, използвайки газова хроматография, свързана с тройна квадруполна масспектрометрия (Varian model 1200, Пало Алто, Калифорния, САЩ). Количественото определяне на пестициди във вода е показано като допълнителен материал (Таблица SM1).
За микронуклеарния тест (MNT) и теста за ядрени аномалии на червените кръвни клетки (RNA) бяха анализирани 15 попови лъжички от всяка третирана група. Поповите лъжички бяха анестезирани с 5% лидокаин (50 mg g-170) и кръвните проби бяха събрани чрез сърдечна пункция с помощта на спринцовки за еднократна употреба с хепарин. Кръвни натривки бяха приготвени върху стерилни микроскопски предметни стъкла, изсушени на въздух, фиксирани със 100% метанол (4°C) за 2 минути и след това оцветени с 10% разтвор на Гимза за 15 минути на тъмно. В края на процеса предметните стъкла бяха измити с дестилирана вода за отстраняване на излишното оцветяване и изсушени на стайна температура.
Най-малко 1000 еритроцита от всяка попова лъжичка бяха анализирани с помощта на 100× микроскоп с обектив 71, за да се определи наличието на MN и ENA. Общо 75 796 еритроцита от попови лъжички бяха оценени, като се вземат предвид концентрациите на циперметрин и контролите. Генотоксичността беше анализирана съгласно метода на Carrasco et al. и Fenech et al.38,72 чрез определяне на честотата на следните ядрени лезии: (1) безядрени клетки: клетки без ядра; (2) апоптотични клетки: ядрена фрагментация, програмирана клетъчна смърт; (3) двуядрени клетки: клетки с две ядра; (4) ядрени пъпки или мехурчета: клетки с ядра с малки издатини на ядрената мембрана, мехурчета, подобни по размер на микроядрата; (5) кариолизирани клетки: клетки само с очертанията на ядрото без вътрешен материал; (6) назъбени клетки: клетки с ядра с очевидни пукнатини или назъбвания във формата им, наричани още ядра с форма на бъбреци; (7) лобулирани клетки: клетки с ядрени издатини, по-големи от гореспоменатите везикули; и (8) микроклетки: клетки с кондензирани ядра и редуцирана цитоплазма. Промените бяха сравнени с резултатите от отрицателната контрола.
Резултатите от теста за остра токсичност (LC50) бяха анализирани с помощта на софтуера GBasic и метода TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Данните от хроничния тест бяха предварително тествани за нормалност на грешките (Shapiro-Wilks) и хомогенност на дисперсията (Bartlett). Резултатите бяха анализирани с помощта на еднофакторен дисперсионен анализ (ANOVA). Тестът на Tukey беше използван за сравняване на данните помежду си, а тестът на Dunnett - за сравняване на данните между лекуваната група и отрицателната контролна група.
Данните за LOEC и NOEC бяха анализирани с помощта на теста на Dunnett. Статистическите тестове бяха проведени с помощта на софтуера Statistica 8.0 (StatSoft) с ниво на значимост 95% (p < 0,05).
Време на публикуване: 13 март 2025 г.