Фосфорилирането активира главния регулатор на растежа DELLA, насърчавайки свързването на хистон H2A с хроматина в Arabidopsis.

DELLA протеините се запазватрегулатори на растежакоито играят централна роля в развитието на растенията в отговор на вътрешни и външни сигнали. Като транскрипционни регулатори, DELLAs се свързват с транскрипционни фактори (TFs) и хистон H2A чрез техните GRAS домейни и се набират да действат върху промотори. Последните проучвания показват, че стабилността на DELLA се регулира посттранслационно чрез два механизма: полиубиквитинация, индуцирана от растителния хормонгиберелин, което води до тяхното бързо разграждане и конюгиране с малък убиквитин-подобен модификатор (SUMO), което увеличава тяхното натрупване. Освен това, активността на DELLA се регулира динамично от два различни механизма на гликозилиране: О-фукозилирането подобрява взаимодействието DELLA-TF, докато модификацията на О-свързан N-ацетилглюкозамин (O-GlcNAc) инхибира взаимодействието DELLA-TF. Ролята на фосфорилирането на DELLA обаче е неясна, тъй като предишни проучвания показват противоречиви резултати, като някои предполагат, че фосфорилирането насърчава или потиска разграждането на DELLA, а други предполагат, че фосфорилирането не засяга тяхната стабилност. Тук ние идентифицираме местата на фосфорилиране в GA1-3 репресора (RGA), AtDELLA, пречистен от Arabidopsis thaliana чрез масспектрометрия и показваме, че фосфорилирането на два RGA пептида в PolyS и PolyS/T регионите повишава RGA активността чрез насърчаване на H2A свързване и RGA асоцииране с целеви промотори. Трябва да се отбележи, че фосфорилирането не повлиява RGA-TF взаимодействията или стабилността на RGA. Нашето изследване разкрива молекулярен механизъм, чрез който фосфорилирането индуцира DELLA активност.
Нашият масспектрометричен анализ разкри, че както Pep1, така и Pep2 са силно фосфорилирани в RGA в Ga1 фон с дефицит на GA. В допълнение към това изследване, фосфопротеомичните изследвания също разкриха Pep1 фосфорилиране в RGA, въпреки че неговата роля все още не е проучена 53, 54, 55. Обратно, Pep2 фосфорилирането не е описано преди, тъй като този пептид може да бъде открит само с помощта на RGAGKG трансгена. Въпреки че m1A мутацията, която премахва Pep1 фосфорилирането, само леко намалява RGA активността в planta, тя има адитивен ефект, когато се комбинира с m2A за намаляване на RGA активността (допълнителна фигура 6). Важно е, че Pep1 фосфорилирането е значително намалено в GA-усиления sly1 мутант в сравнение с ga1, което предполага, че GA насърчава RGA дефосфорилирането, намалявайки неговата активност. Механизмът, чрез който GA потиска RGA фосфорилирането, изисква допълнително изследване. Една възможност е това да се постигне чрез регулиране на неидентифицирана протеин киназа. Въпреки че проучванията показват, че експресията на CK1 протеин киназата EL1 се регулира надолу от GA в ориз41, нашите резултати показват, че мутации от по-висок ред на хомолога на Arabidopsis EL1 (AEL1-4) не намаляват RGA фосфорилирането. В съгласие с нашите резултати, скорошно фосфопротеомично проучване, използващо свръхекспресиращи линии на Arabidopsis AEL и ael троен мутант, не идентифицира никакви DELLA протеини като субстрати на тези кинази56. Когато подготвихме ръкописа, беше съобщено, че GSK3, генът, кодиращ GSK3/SHAGGY-подобна киназа в пшеница (Triticum aestivum), може да фосфорилира DELLA (Rht-B1b)57, въпреки че фосфорилирането на Rht-B1b от GSK3 не е потвърдено в planta. In vitro ензимни реакции в присъствието на GSK3, последвани от масспектрометричен анализ, разкриват три места на фосфорилиране, разположени между DELLA и GRAS домените на Rht-B1b (допълнителна фигура 3). Заместванията на серин с аланин и в трите места на фосфорилиране водят до намалена активност на Rht-B1b в трансгенна пшеница, в съответствие с нашите открития, че заместванията на аланин в Pep2 RGA намаляват активността на RGA. Въпреки това, in vitro тестове за разграждане на протеин допълнително демонстрират, че фосфорилирането може също да стабилизира Rht-B1b57. Това е в контраст с нашите резултати, показващи, че заместванията на аланин в Pep2 RGA не променят неговата стабилност в planta. GSK3 в пшеницата е ортолог на нечувствителен към брасиностероиди протеин 2 (BIN2) в Arabidopsis 57. BIN2 е отрицателен регулатор на BR сигнализирането и BR активира неговия сигнален път, като причинява разграждане на BIN2 58. Ние показахме, че лечението с BR не намалява стабилността на RGA 59 или нивата на фосфорилиране в Arabidopsis (допълнителна фигура 2), което предполага, че е малко вероятно RGA да бъде фосфорилиран от BIN2.
Всички количествени данни бяха статистически анализирани с помощта на Excel и значителните разлики бяха определени с помощта на t-теста на Student. Не са използвани статистически методи за предварително определяне на размера на извадката. Никакви данни не бяха изключени от анализа; експериментът не е рандомизиран; и изследователите са били наясно с разпределението по време на експеримента и оценката на резултатите. Примерните размери са предоставени в легендите на фигурите и във файловете с необработени данни.