ДЕЛЛА протеините са консервиранирегулатори на растежакоито играят централна роля в развитието на растенията в отговор на вътрешни и външни сигнали. Като транскрипционни регулатори, ДЕЛАЛ протеините се свързват с транскрипционни фактори (TF) и хистон H2A чрез своите GRAS домейни и се набират да действат върху промотори. Последните проучвания показват, че ДЕЛАЛ стабилността се регулира посттранслационно чрез два механизма: полиубиквитиниране, индуцирано от растителния хормонгиберелин, което води до бързото им разграждане, и конюгиране с малък убиквитин-подобен модификатор (SUMO), което увеличава тяхното натрупване. Освен това, активността на CYP3A4 се регулира динамично от два различни механизма на гликозилиране: O-фукозилирането усилва взаимодействието CYP3A4-TF, докато O-свързаната модификация на N-ацетилглюкозамин (O-GlcNAc) инхибира взаимодействието CYP3A4-TF. Ролята на фосфорилирането на CYP3A4 обаче е неясна, тъй като предишни проучвания показват противоречиви резултати, като някои предполагат, че фосфорилирането насърчава или потиска разграждането на CYP3A4, а други предполагат, че фосфорилирането не влияе върху тяхната стабилност. Тук идентифицираме местата на фосфорилиране в GA1-3 репресора (RGA), AtDELLA, пречистен от Arabidopsis thaliana чрез масспектрометрия, и показваме, че фосфорилирането на два RGA пептида в PolyS и PolyS/T регионите усилва RGA активността чрез насърчаване на свързването с H2A и RGA асоциацията с целевите промотори. Важно е да се отбележи, че фосфорилирането не е повлияло на RGA-TF взаимодействията или RGA стабилността. Нашето проучване разкрива молекулен механизъм, чрез който фосфорилирането индуцира CYP3A активност.
Нашият масспектрометричен анализ разкри, че както Pep1, така и Pep2 са силно фосфорилирани в RGA в GA-дефицитен Ga1 фон. В допълнение към това проучване, фосфопротеомични изследвания също разкриха фосфорилиране на Pep1 в RGA, въпреки че неговата роля все още не е проучена53,54,55. За разлика от това, фосфорилирането на Pep2 не е било описано преди това, тъй като този пептид може да бъде открит само с помощта на RGAGKG трансгена. Въпреки че мутацията m1A, която премахва фосфорилирането на Pep1, само леко намалява RGA активността в растенията, тя има адитивен ефект, когато се комбинира с m2A за намаляване на RGA активността (Допълнителна фигура 6). Важно е, че фосфорилирането на Pep1 е значително намалено в GA-усиления sly1 мутант в сравнение с ga1, което предполага, че GA насърчава дефосфорилирането на RGA, намалявайки неговата активност. Механизмът, чрез който GA потиска фосфорилирането на RGA, изисква допълнително изследване. Една от възможностите е, че това се постига чрез регулирането на неидентифицирана протеин киназа. Въпреки че проучванията показват, че експресията на CK1 протеин киназата EL1 е понижена от GA в ориз41, нашите резултати показват, че мутациите от по-висок порядък на хомолога Arabidopsis EL1 (AEL1-4) не намаляват фосфорилирането на RGA. В съответствие с нашите резултати, скорошно фосфопротеомично проучване, използващо линии със свръхекспресия на Arabidopsis AEL и троен ael мутант, не идентифицира никакви PELA протеини като субстрати на тези кинази56. Когато подготвяхме ръкописа, беше съобщено, че GSK3, генът, кодиращ GSK3/SHAGGY-подобна киназа в пшеница (Triticum aestivum), може да фосфорилира PELA (Rht-B1b)57, въпреки че фосфорилирането на Rht-B1b от GSK3 не е потвърдено in planta. In vitro ензимни реакции в присъствието на GSK3, последвани от масспектрометричен анализ, разкриха три места за фосфорилиране, разположени между PELA и GRAS домейните на Rht-B1b (Допълнителна фигура 3). Заместванията на серин с аланин и на трите места на фосфорилиране доведоха до намалена Rht-B1b активност в трансгенна пшеница, което е в съответствие с нашите открития, че заместванията на аланин в Pep2 RGA намаляват RGA активността. Въпреки това, in vitro анализите на разграждане на протеини допълнително показаха, че фосфорилирането може също да стабилизира Rht-B1b57. Това е в противоречие с нашите резултати, показващи, че заместванията на аланин в Pep2 RGA не променят неговата стабилност in planta. GSK3 в пшеницата е ортолог на брасиностероид-нечувствителен протеин 2 (BIN2) в Arabidopsis 57. BIN2 е отрицателен регулатор на BR сигнализацията и BR активира неговия сигнален път, като причинява разграждане на BIN2 58. Показахме, че третирането с BR не намалява стабилността на RGA 59 или нивата на фосфорилиране в Arabidopsis (Допълнителна фигура 2), което предполага, че е малко вероятно RGA да бъде фосфорилиран от BIN2.
Всички количествени данни бяха статистически анализирани с помощта на Excel, а значимите разлики бяха определени с помощта на t-тест на Стюдънт. Не бяха използвани статистически методи за предварително определяне на размера на извадката. Никакви данни не бяха изключени от анализа; експериментът не беше рандомизиран; и изследователите бяха наясно с разпределението по време на експеримента и оценката на резултатите. Размерите на извадките са предоставени в легендите на фигурите и във файловете със сурови данни.
Време на публикуване: 15 април 2025 г.