Производството на ориз намалява поради изменението на климата и променливостта му в Колумбия.Регулатори на растежа на растениятаса били използвани като стратегия за намаляване на топлинния стрес при различни култури. Следователно, целта на това проучване беше да се оценят физиологичните ефекти (устична проводимост, общо съдържание на хлорофил, съотношение Fv/Fm на два търговски генотипа ориз, подложени на комбиниран топлинен стрес (високи дневни и нощни температури), температура на короната и относително водно съдържание) и биохимични променливи (съдържание на малонодиалдехид (MDA) и пролинова киселина). Първият и вторият експеримент бяха проведени с растения от два генотипа ориз, съответно Federrose 67 („F67“) и Federrose 2000 („F2000“). И двата експеримента бяха анализирани заедно като серия от експерименти. Установените третирания бяха следните: абсолютен контрол (AC) (оризови растения, отглеждани при оптимални температури (дневна/нощна температура 30/25°C)), контрол на топлинния стрес (SC) [оризови растения, подложени само на комбиниран топлинен стрес (40/25°C). 30°C)], а оризовите растения бяха стресирани и напръскани с регулатори на растежа на растенията (стрес+AUX, стрес+BR, стрес+CK или стрес+GA) два пъти (5 дни преди и 5 дни след топлинен стрес). Пръскането със SA увеличи общото съдържание на хлорофил и на двата сорта (прясното тегло на оризовите растения „F67“ и „F2000“ беше съответно 3,25 и 3,65 mg/g) в сравнение с SC растенията (прясното тегло на растенията „F67“ беше 2,36 и 2,56 mg/g). Листното приложение на CK също така като цяло подобри устичната проводимост на растенията от ориз „F2000“ (499,25 спрямо 150,60 mmol m-2 s) в сравнение с контролата с топлинен стрес. При по-високи температури температурата на короната на растението намалява с 2–3 °C и съдържанието на MDA в растенията намалява. Индексът на относителна толерантност показва, че листното приложение на CK (97,69%) и BR (60,73%) може да помогне за облекчаване на проблема с комбинирания топлинен стрес, главно при оризови растения F2000. В заключение, листното пръскане с BR или CK може да се разглежда като агрономическа стратегия, която помага за намаляване на отрицателните ефекти от условията на комбиниран топлинен стрес върху физиологичното поведение на оризовите растения.
Оризът (Oryza sativa) принадлежи към семейство Житни (Poaceae) и е една от най-култивираните зърнени култури в света, заедно с царевицата и пшеницата (Bajaj and Mohanty, 2005). Площта, заета с ориз, е 617 934 хектара, а националното производство през 2020 г. е 2 937 840 тона със среден добив от 5,02 тона/ха (Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021).
Глобалното затопляне влияе върху оризовите култури, което води до различни видове абиотичен стрес, като високи температури и периоди на суша. Изменението на климата причинява повишаване на глобалните температури; Прогнозира се, че температурите ще се повишат с 1,0–3,7°C през 21-ви век, което би могло да увеличи честотата и интензивността на топлинния стрес. Повишените температури на околната среда са повлияли на ориза, причинявайки спад на добивите с 6–7%. От друга страна, изменението на климата води и до неблагоприятни условия на околната среда за културите, като периоди на тежка суша или високи температури в тропическите и субтропичните райони. Освен това, променливи събития като Ел Ниньо могат да доведат до топлинен стрес и да изострят щетите по реколтата в някои тропически региони. В Колумбия се очаква температурите в районите, произвеждащи ориз, да се повишат с 2–2,5°C до 2050 г., което ще намали производството на ориз и ще се отрази на потоците от продукти към пазарите и веригите за доставки.
Повечето оризови култури се отглеждат в райони, където температурите са близки до оптималния диапазон за растеж на културите (Shah et al., 2011). Съобщава се, че оптималните средни дневни и нощни температури зарастеж и развитие на оризаобикновено са съответно 28°C и 22°C (Kilasi et al., 2018; Calderón-Páez et al., 2021). Температурите над тези прагове могат да причинят периоди на умерен до силен топлинен стрес по време на чувствителни етапи от развитието на ориза (брадене, цветене, цъфтеж и пълнене на зърната), като по този начин се отразяват негативно на добива на зърно. Това намаление на добива се дължи главно на дълги периоди на топлинен стрес, които влияят върху физиологията на растенията. Поради взаимодействието на различни фактори, като продължителност на стреса и достигната максимална температура, топлинният стрес може да причини редица необратими увреждания на метаболизма и развитието на растенията.
Топлинният стрес влияе върху различни физиологични и биохимични процеси в растенията. Листната фотосинтеза е един от процесите, най-чувствителни към топлинен стрес при оризовите растения, тъй като скоростта на фотосинтеза намалява с 50%, когато дневните температури надвишат 35°C. Физиологичните реакции на оризовите растения варират в зависимост от вида на топлинния стрес. Например, скоростта на фотосинтеза и устичната проводимост се инхибират, когато растенията са изложени на високи дневни температури (33–40°C) или високи дневни и нощни температури (35–40°C през деня, 28–30°C). C означава нощ) (Lü et al., 2013; Fahad et al., 2016; Chaturvedi et al., 2017). Високите нощни температури (30°C) причиняват умерено инхибиране на фотосинтезата, но увеличават нощното дишане (Fahad et al., 2016; Alvarado-Sanabria et al., 2017). Независимо от периода на стрес, топлинният стрес влияе и върху съдържанието на хлорофил в листата, съотношението на променливата флуоресценция на хлорофила към максималната флуоресценция на хлорофила (Fv/Fm) и активирането на Rubisco в оризовите растения (Cao et al. 2009; Yin et al. 2010). (Sanchez Reynoso et al., 2014).
Биохимичните промени са друг аспект на адаптацията на растенията към топлинен стрес (Wahid et al., 2007). Съдържанието на пролин се използва като биохимичен индикатор за растителния стрес (Ahmed and Hassan 2011). Пролинът играе важна роля в метаболизма на растенията, тъй като действа като източник на въглерод или азот и като мембранен стабилизатор при условия на висока температура (Sánchez-Reinoso et al., 2014). Високите температури също влияят върху стабилността на мембраните чрез липидна пероксидация, което води до образуването на малонодиалдехид (MDA) (Wahid et al., 2007). Следователно, съдържанието на MDA се използва и за разбиране на структурната цялост на клетъчните мембрани при топлинен стрес (Cao et al., 2009; Chavez-Arias et al., 2018). И накрая, комбинираният топлинен стрес [37/30°C (ден/нощ)] увеличава процента на изтичане на електролити и съдържанието на малонодиалдехид в ориза (Liu et al., 2013).
Употребата на регулатори на растежа на растенията (GR) е оценена за смекчаване на отрицателните ефекти от топлинния стрес, тъй като тези вещества участват активно в растителните реакции или физиологичните защитни механизми срещу такъв стрес (Peleg and Blumwald, 2011; Yin et al. et al., 2011; Ahmed et al., 2015). Екзогенното приложение на генетични ресурси е оказало положителен ефект върху толерантността към топлинен стрес при различни култури. Проучванията показват, че фитохормони като гиберелини (GA), цитокинини (CK), ауксини (AUX) или брасиностероиди (BR) водят до увеличаване на различни физиологични и биохимични променливи (Peleg and Blumwald, 2011; Yin et al. Ren, 2011; Mitler et al., 2012; Zhou et al., 2014). В Колумбия екзогенното приложение на генетични ресурси и неговото въздействие върху оризовите култури не са напълно разбрани и проучени. Въпреки това, предишно проучване показа, че листното пръскане с BR може да подобри толерантността на ориза чрез подобряване на характеристиките на газообмена, съдържанието на хлорофил или пролин в листата на оризовия разсад (Quintero-Calderón et al., 2021).
Цитокинините медиират растителните реакции към абиотични стресове, включително топлинен стрес (Ha et al., 2012). Освен това е съобщено, че екзогенното приложение на CK може да намали термичните увреждания. Например, екзогенното приложение на зеатин увеличава скоростта на фотосинтеза, съдържанието на хлорофил a и b и ефективността на електронния транспорт при пълзящата бентаграс (Agrotis estolonifera) по време на топлинен стрес (Xu and Huang, 2009; Jespersen and Huang, 2015). Екзогенното приложение на зеатин може също да подобри антиоксидантната активност, да засили синтеза на различни протеини, да намали увреждането от реактивни кислородни видове (ROS) и производството на малонов диалдехид (MDA) в растителните тъкани (Chernyadyev, 2009; Yang et al., 2009). , 2016; Kumar et al., 2020).
Употребата на гиберелинова киселина също показва положителен отговор на топлинен стрес. Проучванията показват, че биосинтезата на GA медиира различни метаболитни пътища и повишава толерантността при условия на висока температура (Alonso-Ramirez et al. 2009; Khan et al. 2020). Abdel-Nabi et al. (2020) установяват, че листното пръскане с екзогенна GA (25 или 50 mg*L) може да увеличи скоростта на фотосинтеза и антиоксидантната активност при стресирани от топлина портокалови растения в сравнение с контролните растения. Наблюдавано е също, че екзогенното приложение на HA увеличава относителното съдържание на влага, съдържанието на хлорофил и каротеноиди и намалява липидната пероксидация във фурмова палма (Phoenix dactylifera) при топлинен стрес (Khan et al., 2020). Ауксинът също играе важна роля в регулирането на адаптивните растежни реакции към условия на висока температура (Sun et al., 2012; Wang et al., 2016). Този регулатор на растежа действа като биохимичен маркер в различни процеси, като синтез или разграждане на пролин при абиотичен стрес (Ali et al. 2007). Освен това, AUX също така засилва антиоксидантната активност, което води до намаляване на MDA в растенията поради намалена липидна пероксидация (Bielach et al., 2017). Sergeev et al. (2018) наблюдават, че в граховите растения (Pisum sativum) при топлинен стрес съдържанието на пролин – диметиламиноетоксикарбонилметил)нафтилхлорометил етер (TA-14) се увеличава. В същия експеримент те наблюдават и по-ниски нива на MDA в третираните растения в сравнение с растенията, нетретирани с AUX.
Брасиностероидите са друг клас регулатори на растежа, използвани за смекчаване на ефектите от топлинния стрес. Ogweno et al. (2008) съобщават, че екзогенното пръскане с BR увеличава нетната скорост на фотосинтеза, устичната проводимост и максималната скорост на Rubisco карбоксилиране на доматени (Solanum lycopersicum) растения при топлинен стрес в продължение на 8 дни. Листното пръскане с епибрасиностероиди може да увеличи нетната скорост на фотосинтеза на краставични (Cucumis sativus) растения при топлинен стрес (Yu et al., 2004). Освен това, екзогенното приложение на BR забавя разграждането на хлорофила и увеличава ефективността на използване на вода и максималния квантов добив на фотохимията на PSII при растения при топлинен стрес (Holá et al., 2010; Toussagunpanit et al., 2015).
Поради изменението на климата и променливостта, оризовите култури са изправени пред периоди на високи дневни температури (Lesk et al., 2016; Garcés, 2020; Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021). При фенотипирането на растенията използването на фитонутриенти или биостимуланти е изследвано като стратегия за смекчаване на топлинния стрес в районите за отглеждане на ориз (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderón et al., 2021). Освен това, използването на биохимични и физиологични променливи (температура на листата, устична проводимост, параметри на хлорофилната флуоресценция, хлорофилно и относително водно съдържание, синтез на малонодиалдехид и пролин) е надежден инструмент за скрининг на оризови растения при топлинен стрес на местно и международно ниво (Sánchez-Reynoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2017; Въпреки това, изследванията върху използването на листни фитохормонални спрейове при ориз на местно ниво остават редки. Следователно, изучаването на физиологичните и биохимичните реакции от прилагането на регулатори на растежа на растенията е от голямо значение за предлагането на практически агрономически стратегии за това. Целта на това проучване е да се оценят физиологичните (устична проводимост, параметри на хлорофилната флуоресценция и относително водно съдържание) и биохимичните ефекти от листното приложение на четири регулатора на растежа на растенията (AUX, CK, GA и BR). (Фотосинтетични пигменти, съдържание на малонодиалдехид и пролин) Променливи в два търговски генотипа ориз, подложени на комбиниран топлинен стрес (висок дневен/нощен режим). температури).
В това проучване бяха проведени два независими експеримента. Генотиповете Federrose 67 (F67: генотип, разработен при високи температури през последното десетилетие) и Federrose 2000 (F2000: генотип, разработен през последното десетилетие на 20-ти век, показващ устойчивост към вируса на белите листа) бяха използвани за първи път. Във втория експеримент, съответно, и двата генотипа се култивират широко от колумбийски фермери. Семената бяха засети в 10-литрови тави (дължина 39,6 см, ширина 28,8 см, височина 16,8 см), съдържащи песъчливо-глинеста почва с 2% органично вещество. Във всяка тава бяха засадени по пет предварително покълнали семена. Палетите бяха поставени в оранжерията на Факултета по селскостопански науки на Националния университет на Колумбия, кампус в Богота (43°50′56″ северна ширина, 74°04′051″ западна дължина), на надморска височина от 2556 м. м.) и са проведени от октомври до декември 2019 г. Един експеримент (Federroz 67) и втори експеримент (Federroz 2000) през същия сезон на 2020 г.
Условията на околната среда в оранжерията през всеки сезон на засаждане са следните: дневна и нощна температура 30/25°C, относителна влажност 60~80%, естествен фотопериод 12 часа (фотосинтетично активна радиация 1500 µmol (фотони) m-2 s-). 1 на обяд. Растенията са торени според съдържанието на всеки елемент 20 дни след поникването на семената (DAE), съгласно Sánchez-Reinoso et al. (2019): 670 mg азот на растение, 110 mg фосфор на растение, 350 mg калий на растение, 68 mg калций на растение, 20 mg магнезий на растение, 20 mg сяра на растение, 17 mg силиций на растение. Растенията съдържат 10 mg бор на растение, 17 mg мед на растение и 44 mg цинк на растение. Оризовите растения са поддържани при до 47 DAE във всеки експеримент, когато достигат фенологичен стадий V5 през този период. Предишни проучвания показват, че този фенологичен етап е подходящ момент за провеждане на изследвания на топлинния стрес при ориза (Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2017).
Във всеки експеримент бяха извършени две отделни приложения на регулатора на растежа на листата. Първият комплект листни фитохормонални пръскания беше приложен 5 дни преди третирането с топлинен стрес (42 DAE), за да се подготвят растенията за стрес от околната среда. Второ листно пръскане беше извършено 5 дни след като растенията бяха изложени на стресови условия (52 DAE). Използвани бяха четири фитохормона и свойствата на всяка активна съставка, пръскана в това проучване, са изброени в Допълнителна таблица 1. Концентрациите на използваните регулатори на растежа на листата бяха следните: (i) Ауксин (1-нафтилоцетна киселина: NAA) в концентрация 5 × 10⁻⁶ M (ii) 5 × 10–5 M гиберелин (гиберелинова киселина: NAA); GA3); (iii) Цитокинин (транс-зеатин) 1 × 10⁻⁶ M (iv) Брасиностероиди [Спиростан-6-он, 3,5-дихидрокси-, (3b,5a,25R)] 5 × 10⁻⁶; M. Тези концентрации бяха избрани, защото предизвикват положителни реакции и повишават устойчивостта на растенията към топлинен стрес (Zahir et al., 2001; Wen et al., 2010; El-Bassiony et al., 2012; Salehifar et al., 2017). Оризовите растения без пръскания с регулатор на растежа на растенията бяха третирани само с дестилирана вода. Всички оризови растения бяха напръскани с ръчна пръскачка. Нанесете 20 ml H2O върху растението, за да навлажните горната и долната повърхност на листата. Всички листни пръскания използваха селскостопански адювант (Agrotin, Bayer CropScience, Колумбия) в концентрация 0,1% (v/v). Разстоянието между саксията и пръскачката е 30 cm.
Третирането на топлинен стрес беше проведено 5 дни след първото листно пръскане (47 DAE) във всеки експеримент. Оризовите растения бяха прехвърлени от оранжерията в камера за растеж с обем 294 литра (MLR-351H, Sanyo, IL, USA), за да се установи топлинен стрес или да се поддържат същите условия на околната среда (47 DAE). Комбинираното третиране на топлинен стрес беше проведено чрез настройване на камерата на следните дневни/нощни температури: висока дневна температура [40°C за 5 часа (от 11:00 до 16:00)] и нощен период [30°C за 5 часа], 8 дни подред (от 19:00 до 24:00). Температурата на стреса и времето на експозиция бяха избрани въз основа на предишни проучвания (Sánchez-Reynoso et al. 2014; Alvarado-Sanabria et al. 2017). От друга страна, група растения, прехвърлени в камерата за растеж, бяха държани в оранжерията при същата температура (30°C през деня/25°C през нощта) в продължение на 8 последователни дни.
В края на експеримента бяха получени следните третирани групи: (i) условия на температура на растеж + прилагане на дестилирана вода [Абсолютен контрол (AC)], (ii) условия на топлинен стрес + прилагане на дестилирана вода [Контрол на топлинен стрес (SC)], (iii) условия на топлинен стрес + прилагане на ауксин (AUX), (iv) условия на топлинен стрес + прилагане на гиберелин (GA), (v) условия на топлинен стрес + прилагане на цитокинин (CK) и (vi) условия на топлинен стрес + брасиностероид (BR) Апендикс. Тези третирани групи бяха използвани за два генотипа (F67 и F2000). Всички третирания бяха проведени по напълно рандомизиран дизайн с пет повторения, всяко от които се състоеше от едно растение. Всяко растение беше използвано за отчитане на променливите, определени в края на експеримента. Експериментът продължи 55 дни след експеримента.
Устичната проводимост (gs) беше измерена с помощта на преносим порометр (SC-1, METER Group Inc., САЩ) в диапазон от 0 до 1000 mmol m-2 s-1, с отвор на камерата за проби 6,35 mm. Измерванията се извършват чрез прикрепване на стомаметрична сонда към зрял лист с напълно разгънат основен издънка на растението. За всяко третиране, gs показанията бяха взети на три листа от всяко растение между 11:00 и 16:00 часа и осреднени.
RWC беше определено съгласно метода, описан от Ghoulam et al. (2002). Напълно разгънатият лист, използван за определяне на g, също беше използван за измерване на RWC. Свежо тегло (FW) беше определено веднага след прибиране на реколтата с помощта на цифрова везна. След това листата бяха поставени в пластмасов контейнер, напълнен с вода, и оставени на тъмно при стайна температура (22°C) за 48 часа. След това претеглени на цифрова везна и записано разгънато тегло (TW). Подутите листа бяха изсушени във фурна при 75°C за 48 часа и беше записано сухото им тегло (DW).
Относителното съдържание на хлорофил беше определено с помощта на хлорофил метър (atLeafmeter, FT Green LLC, САЩ) и изразено в atLeaf единици (Dey et al., 2016). Показанията на максималната квантова ефективност на PSII (съотношение Fv/Fm) бяха записани с помощта на хлорофил флуориметър с непрекъснато възбуждане (Handy PEA, Hansatech Instruments, Великобритания). Листата бяха адаптирани към тъмнина с помощта на листни скоби за 20 минути преди измерванията на Fv/Fm (Restrepo-Diaz and Garces-Varon, 2013). След като листата бяха аклиматизирани към тъмнина, бяха измерени базовата линия (F0) и максималната флуоресценция (Fm). От тези данни бяха изчислени променливата флуоресценция (Fv = Fm – F0), съотношението на променливата флуоресценция към максималната флуоресценция (Fv/Fm), максималният квантов добив на фотохимията на PSII (Fv/F0) и съотношението Fm/F0 (Baker, 2008; Lee et al., 2017). Отчитанията на относителния хлорофил и хлорофилната флуоресценция са взети на същите листа, използвани за gs измервания.
Приблизително 800 mg от теглото на листата в прясно състояние бяха събрани като биохимични променливи. След това пробите от листа бяха хомогенизирани в течен азот и съхранени за по-нататъшен анализ. Спектрометричният метод, използван за оценка на съдържанието на тъканен хлорофил a, b и каротеноиди, се основава на метода и уравненията, описани от Wellburn (1994). Проби от листна тъкан (30 mg) бяха събрани и хомогенизирани в 3 ml 80% ацетон. След това пробите бяха центрофугирани (модел 420101, Becton Dickinson Primary Care Diagnostics, САЩ) при 5000 rpm за 10 минути за отстраняване на частиците. Супернатантът беше разреден до краен обем от 6 ml чрез добавяне на 80% ацетон (Sims and Gamon, 2002). Съдържанието на хлорофил беше определено при 663 (хлорофил a) и 646 (хлорофил b) nm, а на каротеноиди при 470 nm, използвайки спектрофотометър (Spectronic BioMate 3 UV-vis, Thermo, САЩ).
Методът с тиобарбитурова киселина (TBA), описан от Hodges et al. (1999), е използван за оценка на мембранната липидна пероксидация (MDA). Приблизително 0,3 g листна тъкан също е хомогенизирана в течен азот. Пробите са центрофугирани при 5000 rpm и абсорбцията е измерена на спектрофотометър при 440, 532 и 600 nm. Накрая, концентрацията на MDA е изчислена с помощта на коефициента на екстинкция (157 M mL−1).
Съдържанието на пролин във всички третирания е определено по метода, описан от Bates et al. (1973). Към съхранената проба се добавят 10 ml 3% воден разтвор на сулфосалицилова киселина и се филтрира през филтърна хартия Whatman (№ 2). След това 2 ml от този филтрат реагират с 2 ml нинахидринова киселина и 2 ml ледена оцетна киселина. Сместа се поставя във водна баня при 90°C за 1 час. Реакцията се спира чрез инкубиране върху лед. Епруветката се разклаща енергично с помощта на вихров шейкър и полученият разтвор се разтваря в 4 ml толуен. Показанията на абсорбцията са определени при 520 nm, като се използва същият спектрофотометър, използван за количествено определяне на фотосинтетични пигменти (Spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Madison, WI, USA).
Методът, описан от Gerhards et al. (2016), за изчисляване на температурата на короната и CSI. Термографиите са направени с FLIR 2 камера (FLIR Systems Inc., Бостън, Масачузетс, САЩ) с точност от ±2°C в края на стресовия период. Поставете бяла повърхност зад растението за фотография. Отново две фабрики са разгледани като референтни модели. Растенията са поставени върху бяла повърхност; едната е покрита със селскостопански адювант (Agrotin, Bayer CropScience, Богота, Колумбия), за да се симулира отварянето на всички устици [мокрен режим (Twet)], а другата е лист без никакво приложение [сух режим (Tdry)] (Castro-Duque et al., 2020). Разстоянието между камерата и саксията по време на заснемането е 1 м.
Индексът на относителна толерантност беше изчислен индиректно, използвайки устичната проводимост (gs) на третираните растения в сравнение с контролните растения (растения без стрес третиране и с приложени растежни регулатори), за да се определи толерантността на третираните генотипове, оценени в това проучване. RTI беше получен с помощта на уравнение, адаптирано от Chávez-Arias et al. (2020).
Във всеки експеримент всички гореспоменати физиологични променливи бяха определени и записани при 55 DAE, използвайки напълно разраснали се листа, събрани от горния листен покрив. Освен това, измерванията бяха проведени в камера за растеж, за да се избегне промяна на условията на околната среда, в които растенията растат.
Данните от първия и втория експеримент бяха анализирани заедно като серия от експерименти. Всяка експериментална група се състоеше от 5 растения, като всяко растение представляваше експериментална единица. Извършен беше дисперсионен анализ (ANOVA) (P ≤ 0,05). Когато бяха открити значителни разлики, беше използван post hoc сравнителният тест на Tukey при P ≤ 0,05. Използвайте функцията арксинус за преобразуване на процентните стойности. Данните бяха анализирани с помощта на софтуера Statistix v 9.0 (Analytical Software, Талахаси, Флорида, САЩ) и нанесени на графика с помощта на SigmaPlot (версия 10.0; Systat Software, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Анализът на основните компоненти беше извършен с помощта на софтуера InfoStat 2016 (Analysis Software, Национален университет в Кордоба, Аржентина), за да се идентифицират най-добрите регулатори на растежа на растенията, които са предмет на изследване.
Таблица 1 обобщава ANOVA, показваща експериментите, различните третирания и техните взаимодействия с фотосинтетичните пигменти на листата (хлорофил a, b, общ и каротеноиди), съдържанието на малонодиалдехид (MDA) и пролин, както и устичната проводимост. Влияние на gs, относително водно съдържание (RWC), съдържание на хлорофил, параметри на флуоресценция на хлорофил алфа, температура на короната (PCT) (°C), индекс на стрес на културата (CSI) и индекс на относителна толерантност на оризовите растения при 55 DAE.
Таблица 1. Обобщение на ANOVA данни за физиологичните и биохимичните променливи на ориза между експериментите (генотипове) и третиранията с топлинен стрес.
Разликите (P≤0,01) във взаимодействията на фотосинтетичните пигменти в листата, относителното съдържание на хлорофил (показания на Atleaf) и параметрите на флуоресценция на алфа-хлорофила между експериментите и третиранията са показани в Таблица 2. Високите дневни и нощни температури повишават общото съдържание на хлорофил и каротеноиди. Оризовите разсади без листно пръскане с фитохормони (2,36 mg g-1 за „F67“ и 2,56 mg g-1 за „F2000“) в сравнение с растения, отглеждани при оптимални температурни условия (2,67 mg g-1)), показват по-ниско общо съдържание на хлорофил. И в двата експеримента „F67“ е 2,80 mg g-1, а „F2000“ е 2,80 mg g-1. Освен това, оризовите разсади, третирани с комбинация от AUX и GA спрейове при топлинен стрес, също показват намаление на съдържанието на хлорофил и в двата генотипа (AUX = 1,96 mg g-1 и GA = 1,45 mg g-1 за „F67“; AUX = 1,96 mg g-1 и GA = 1,45 mg g-1 за „F67“; AUX = 2,24 mg g-1 и GA = 1,43 mg g-1 (за „F2000“) при условия на топлинен стрес. При условия на топлинен стрес, листното третиране с BR доведе до леко увеличение на тази променлива и в двата генотипа. Накрая, листното пръскане с CK показа най-високите стойности на фотосинтетични пигменти сред всички третирания (третирания AUX, GA, BR, SC и AC) при генотипове F67 (3,24 mg g-1) и F2000 (3,65 mg g-1). Относителното съдържание на хлорофил (единица Atleaf) също е намалено от комбинирания топлинен стрес. Най-високите стойности са регистрирани и при растения, пръскани с CC и при двата генотипа (41,66 за „F67“ и 49,30 за „F2000“). Съотношенията Fv и Fv/Fm показват значителни разлики между третиранията и сортовете (Таблица 2). Като цяло, сред тези променливи, сорт F67 е по-малко податлив на топлинен стрес от сорт F2000. Съотношенията Fv и Fv/Fm са пострадали повече във втория експеримент. Стресираните разсади от „F2000“, които не са били пръскани с никакви фитохормони, са имали най-ниските стойности на Fv (2120,15) и съотношения Fv/Fm (0,59), но листното пръскане с CK е помогнало за възстановяването на тези стойности (Fv: 2591,89, съотношение Fv/Fm: 0,73). , получавайки показания, подобни на тези, регистрирани при растения „F2000“, отглеждани при оптимални температурни условия (Fv: 2955,35, съотношение Fv/Fm: 0,73:0,72). Нямаше значителни разлики в началната флуоресценция (F0), максималната флуоресценция (Fm), максималния фотохимичен квантов добив на PSII (Fv/F0) и съотношението Fm/F0. Накрая, BR показа подобна тенденция, както наблюдаваната при CK (Fv 2545,06, съотношение Fv/Fm 0,73).
Таблица 2. Ефект на комбинирания топлинен стрес (40°/30°C ден/нощ) върху фотосинтетичните пигменти на листата [общ хлорофил (Chl Total), хлорофил a (Chl a), хлорофил b (Chl b) и каротеноиди Cx+c] ефект], относително съдържание на хлорофил (единица Atliff), параметри на хлорофилната флуоресценция (начална флуоресценция (F0), максимална флуоресценция (Fm), променлива флуоресценция (Fv), максимална ефективност на PSII (Fv/Fm), фотохимичен максимален квантов добив на PSII (Fv/F0) и Fm/F0 в растения от два генотипа ориз [Federrose 67 (F67) и Federrose 2000 (F2000)] 55 дни след поникване (DAE)).
Относителното водно съдържание (RWC) на различно третираните оризови растения показва разлики (P ≤ 0,05) във взаимодействието между експерименталните и листните третирания (фиг. 1А). При третиране със SA, най-ниските стойности са регистрирани и за двата генотипа (74,01% за F67 и 76,6% за F2000). При условия на топлинен стрес, RWC на оризовите растения от двата генотипа, третирани с различни фитохормони, се е увеличило значително. Като цяло, листните приложения на CK, GA, AUX или BR са увеличили RWC до стойности, подобни на тези на растенията, отглеждани при оптимални условия по време на експеримента. Абсолютният контрол и листно пръсканите растения са регистрирали стойности от около 83% за двата генотипа. От друга страна, gs също показват значителни разлики (P ≤ 0,01) във взаимодействието експеримент-третиране (фиг. 1B). Абсолютно контролното (AC) растение също регистрира най-високи стойности за всеки генотип (440.65 mmol m-2s-1 за F67 и 511.02 mmol m-2s-1 за F2000). Оризовите растения, подложени само на комбиниран топлинен стрес, показаха най-ниските стойности на gs и за двата генотипа (150.60 mmol m-2s-1 за F67 и 171.32 mmol m-2s-1 за F2000). Листното третиране с всички регулатори на растежа на растенията също увеличи g. При оризовите растения F2000, пръскани с CC, ефектът от листното пръскане с фитохормони беше по-очевиден. Тази група растения не показа разлики в сравнение с растенията от абсолютния контрол (AC 511.02 и CC 499.25 mmol m-2s-1).
Фигура 1. Влияние на комбинирания топлинен стрес (40°/30°C ден/нощ) върху относителното съдържание на вода (RWC) (A), устичната проводимост (gs) (B), производството на малононов диалдехид (MDA) (C) и съдържанието на пролин (D) в растения от два генотипа ориз (F67 и F2000) на 55 дни след поникването (DAE). Третиранията, оценени за всеки генотип, включват: абсолютен контрол (AC), контрол на топлинен стрес (SC), топлинен стрес + ауксин (AUX), топлинен стрес + гиберелин (GA), топлинен стрес + клетъчен митоген (CK) и топлинен стрес + брасиностероид (BR). Всяка колона представлява средната стойност ± стандартна грешка на пет точки от данни (n = 5). Колоните, последвани от различни букви, показват статистически значими разлики според теста на Tukey (P ≤ 0,05). Буквите със знак за равенство показват, че средната стойност не е статистически значима (≤ 0,05).
Съдържанието на MDA (P ≤ 0,01) и пролин (P ≤ 0,01) също показва значителни разлики във взаимодействието между експерименталното третиране и третирането с фитохормони (фиг. 1C, D). Повишена липидна пероксидация е наблюдавана при третиране с SC и в двата генотипа (фигура 1C), но растенията, третирани със спрей с регулатор на растежа на листата, показват намалена липидна пероксидация и в двата генотипа; Като цяло, използването на фитохормони (CA, AUC, BR или GA) води до намаляване на липидната пероксидация (съдържание на MDA). Не са открити разлики между AC растения от два генотипа и растения под топлинен стрес и пръскани с фитохормони (наблюдаваните стойности на FW при растения „F67“ варират от 4,38–6,77 µmol g-1, а при FW растения „F2000“ наблюдаваните стойности варират от 2,84 до 9,18 µmol g-1 (растения). От друга страна, синтезът на пролин при растения „F67“ е по-нисък, отколкото при растения „F2000“ под комбиниран стрес, което води до увеличаване на производството на пролин. При топлинно стресирани оризови растения и в двата експеримента е наблюдавано, че прилагането на тези хормони значително увеличава съдържанието на аминокиселини в растения F2000 (AUX и BR са съответно 30,44 и 18,34 µmol g-1) (фиг. 1G).
Ефектите от листното пръскане с регулатор на растежа на растенията и комбинирания топлинен стрес върху температурата на короната на растенията и индекса на относителна толерантност (RTI) са показани на Фигури 2А и Б. И за двата генотипа температурата на короната на AC растенията е била близо до 27°C, а тази на SC растенията е била около 28°C. Наблюдавано е също, че листните третирания с CK и BR са довели до намаление на температурата на короната с 2–3°C в сравнение с SC растенията (Фигура 2А). RTI показва подобно поведение на други физиологични променливи, показвайки значителни разлики (P ≤ 0,01) във взаимодействието между експеримента и третирането (Фигура 2Б). SC растенията показват по-ниска толерантност и при двата генотипа (съответно 34,18% и 33,52% за оризовите растения „F67“ и „F2000“). Листното подхранване с фитохормони подобрява RTI при растения, изложени на висок температурен стрес. Този ефект е по-изразен при растения „F2000“, пръскани с CC, при които RTI е 97,69. От друга страна, значителни разлики са наблюдавани само в индекса на добив (CSI) на оризовите растения при стресови условия от листно пръскане (P ≤ 0,01) (фиг. 2B). Само оризовите растения, подложени на сложен топлинен стрес, показват най-висока стойност на индекса на стрес (0,816). Когато оризовите растения са пръскани с различни фитохормони, индексът на стрес е по-нисък (стойности от 0,6 до 0,67). Накрая, оризовото растение, отглеждано при оптимални условия, има стойност от 0,138.
Фигура 2. Ефекти от комбинирания топлинен стрес (40°/30°C ден/нощ) върху температурата на короната (A), индекса на относителна толерантност (RTI) (B) и индекса на стрес на културите (CSI) (C) на два растителни вида. Търговските генотипове ориз (F67 и F2000) бяха подложени на различни топлинни обработки. Оценяваните обработки за всеки генотип включваха: абсолютен контрол (AC), контрол на топлинния стрес (SC), топлинен стрес + ауксин (AUX), топлинен стрес + гиберелин (GA), топлинен стрес + клетъчен митоген (CK) и топлинен стрес + брасиностероид (BR). Комбинираният топлинен стрес включва излагане на оризовите растения на високи дневни/нощни температури (40°/30°C ден/нощ). Всяка колона представлява средната стойност ± стандартна грешка на пет точки от данни (n = 5). Колоните, последвани от различни букви, показват статистически значими разлики според теста на Tukey (P ≤ 0,05). Буквите със знак за равенство показват, че средната стойност не е статистически значима (≤ 0,05).
Анализът на главните компоненти (PCA) показа, че променливите, оценени при 55 DAE, обясняват 66,1% от физиологичните и биохимичните реакции на топлинно стресирани оризови растения, третирани със спрей с растежен регулатор (фиг. 3). Векторите представляват променливи, а точките представляват регулатори на растежа на растенията (GR). Векторите на gs, съдържание на хлорофил, максимална квантова ефективност на PSII (Fv/Fm) и биохимични параметри (TChl, MDA и пролин) са под близки ъгли спрямо началото на координатната система, което показва висока корелация между физиологичното поведение на растенията и тяхната променлива. Една група (V) включва оризови разсади, отглеждани при оптимална температура (AT), и растения F2000, третирани с CK и BA. В същото време по-голямата част от растенията, третирани с GR, образуват отделна група (IV), а третирането с GA през F2000 образува отделна група (II). За разлика от тях, топлинно стресираните оризови разсади (групи I и III) без листно пръскане с фитохормони (и двата генотипа бяха SC) се намират в зона, противоположна на група V, което демонстрира ефекта на топлинния стрес върху физиологията на растенията.
Фигура 3. Биографичен анализ на ефектите от комбинирания топлинен стрес (40°/30°C ден/нощ) върху растения от два генотипа ориз (F67 и F2000) на 55 дни след поникване (DAE). Съкращения: AC F67, абсолютен контрол F67; SC F67, контрол на топлинен стрес F67; AUX F67, топлинен стрес + ауксин F67; GA F67, топлинен стрес + гиберелин F67; CK F67, топлинен стрес + клетъчно делене BR F67, топлинен стрес + брасиностероид. F67; AC F2000, абсолютен контрол F2000; SC F2000, контрол на топлинен стрес F2000; AUX F2000, топлинен стрес + ауксин F2000; GA F2000, топлинен стрес + гиберелин F2000; CK F2000, топлинен стрес + цитокинин, BR F2000, топлинен стрес + месингов стероид; F2000.
Променливи като съдържание на хлорофил, устична проводимост, съотношение Fv/Fm, CSI, MDA, RTI и съдържание на пролин могат да помогнат за разбирането на адаптацията на генотипите ориз и за оценка на въздействието на агрономическите стратегии при топлинен стрес (Sarsu et al., 2018; Quintero-Calderon et al., 2021). Целта на този експеримент беше да се оцени ефектът от прилагането на четири регулатора на растежа върху физиологичните и биохимичните параметри на оризовите разсади при условия на сложен топлинен стрес. Тестването на разсад е прост и бърз метод за едновременна оценка на оризовите растения в зависимост от размера или състоянието на наличната инфраструктура (Sarsu et al. 2018). Резултатите от това проучване показват, че комбинираният топлинен стрес предизвиква различни физиологични и биохимични реакции при двата генотипа ориз, което показва процес на адаптация. Тези резултати също така показват, че листните спрейове с регулатори на растежа (главно цитокинини и брасиностероиди) помагат на ориза да се адаптира към сложен топлинен стрес, тъй като благоприятното въздействие засяга главно gs, RWC, съотношението Fv/Fm, фотосинтетичните пигменти и съдържанието на пролин.
Приложението на регулатори на растежа спомага за подобряване на водния статус на оризовите растения при топлинен стрес, което може да е свързано с по-висок стрес и по-ниски температури на растителния коронен лист. Това проучване показа, че сред растенията от „F2000“ (чувствителен генотип), оризовите растения, третирани предимно с CK или BR, имат по-високи стойности на gs и по-ниски стойности на PCT в сравнение с растенията, третирани със SC. Предишни проучвания също така показват, че gs и PCT са точни физиологични индикатори, които могат да определят адаптивния отговор на оризовите растения и ефектите от агрономическите стратегии върху топлинния стрес (Restrepo-Diaz and Garces-Varon, 2013; Sarsu et al., 2018; Quintero). -Carr DeLong et al., 2021). Листните CK или BR повишават g при стрес, защото тези растителни хормони могат да стимулират отварянето на устицата чрез синтетични взаимодействия с други сигнални молекули като ABA (промотор на затварянето на устицата при абиотичен стрес) (Macková et al., 2013; Zhou et al., 2013). 2013). , 2014). Отварянето на устицата насърчава охлаждането на листата и помага за намаляване на температурите на короната (Sonjaroon et al., 2018; Quintero-Calderón et al., 2021). Поради тези причини температурата на короната на оризовите растения, пръскани с CK или BR, може да бъде по-ниска при комбиниран топлинен стрес.
Високотемпературният стрес може да намали съдържанието на фотосинтетични пигменти в листата (Chen et al., 2017; Ahammed et al., 2018). В това проучване, когато оризовите растения са били подложени на топлинен стрес и не са били пръскани с никакви регулатори на растежа на растенията, фотосинтетичните пигменти са имали тенденция да намаляват и в двата генотипа (Таблица 2). Feng et al. (2013) също съобщават за значително намаляване на съдържанието на хлорофил в листата на два генотипа пшеница, изложени на топлинен стрес. Излагането на високи температури често води до намалено съдържание на хлорофил, което може да се дължи на намалена биосинтеза на хлорофил, разграждане на пигментите или техните комбинирани ефекти при топлинен стрес (Fahad et al., 2017). Въпреки това, оризовите растения, третирани главно с CK и BA, са увеличили концентрацията на фотосинтетични пигменти в листата при топлинен стрес. Подобни резултати са докладвани и от Jespersen and Huang (2015) и Suchsagunpanit et al. (2015), които наблюдават увеличение на съдържанието на хлорофил в листата след прилагане на зеатин и епибрасиностероидни хормони съответно при топлинно стресирана бенграс и ориз. Разумно обяснение защо CK и BR насърчават повишено съдържание на хлорофил в листата при комбиниран топлинен стрес е, че CK може да засили инициирането на устойчива индукция на експресионни промотори (като промотора, активиращ стареенето (SAG12) или промотора HSP18) и да намали загубата на хлорофил в листата, да забави стареенето на листата и да увеличи устойчивостта на растенията на топлина (Liu et al., 2020). BR може да защити хлорофила в листата и да увеличи съдържанието му чрез активиране или индуциране на синтеза на ензими, участващи в биосинтеза на хлорофила при стресови условия (Sharma et al., 2017; Siddiqui et al., 2018). И накрая, два фитохормона (CK и BR) също насърчават експресията на протеини на топлинния шок и подобряват различни метаболитни процеси на адаптация, като например повишена биосинтеза на хлорофил (Sharma et al., 2017; Liu et al., 2020).
Параметрите на флуоресценция на хлорофил а предоставят бърз и неразрушителен метод, който може да оцени толерантността или адаптацията на растенията към абиотични стресови условия (Chaerle et al. 2007; Kalaji et al. 2017). Параметри като съотношението Fv/Fm са използвани като индикатори за адаптация на растенията към стресови условия (Alvarado-Sanabria et al. 2017; Chavez-Arias et al. 2020). В това проучване, SC растенията показват най-ниските стойности на тази променлива, предимно оризови растения „F2000“. Yin et al. (2010) също така установяват, че съотношението Fv/Fm на най-високо братящите се оризови листа намалява значително при температури над 35°C. Според Feng et al. (2013), по-ниското съотношение Fv/Fm при топлинен стрес показва, че скоростта на улавяне и преобразуване на енергията на възбуждане от реакционния център PSII е намалена, което показва, че реакционният център PSII се разпада при топлинен стрес. Това наблюдение ни позволява да заключим, че нарушенията във фотосинтетичния апарат са по-изразени при чувствителните сортове (Fedearroz 2000), отколкото при резистентните сортове (Fedearroz 67).
Използването на CK или BR като цяло подобрява ефективността на PSII при условия на сложен топлинен стрес. Подобни резултати са получени от Suchsagunpanit et al. (2015), които наблюдават, че прилагането на BR повишава ефективността на PSII при топлинен стрес при ориз. Kumar et al. (2020) също така установяват, че растенията на нахут, третирани с CK (6-бензиладенин) и подложени на топлинен стрес, увеличават съотношението Fv/Fm, заключавайки, че листното приложение на CK чрез активиране на зеаксантиновия пигментен цикъл насърчава активността на PSII. В допълнение, листното пръскане с BR благоприятства фотосинтезата на PSII при комбинирани стресови условия, което показва, че прилагането на този фитохормон води до намалено разсейване на енергията на възбуждане на антените на PSII и насърчава натрупването на малки протеини на топлинен шок в хлоропластите (Ogweno et al. 2008; Kothari and Lachowitz, 2021).
Съдържанието на MDA и пролин често се увеличава, когато растенията са под абиотичен стрес, в сравнение с растенията, отглеждани при оптимални условия (Alvarado-Sanabria et al. 2017). Предишни проучвания също така показват, че нивата на MDA и пролин са биохимични показатели, които могат да се използват за разбиране на процеса на адаптация или въздействието на агрономическите практики при ориза при високи дневни или нощни температури (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Quintero-Calderón et al. . , 2021). Тези проучвания също така показват, че съдържанието на MDA и пролин е с тенденция да бъде по-високо в оризовите растения, изложени на високи температури съответно през нощта или през деня. Листното пръскане с CK и BR обаче допринася за намаляване на MDA и повишаване на нивата на пролин, главно в толерантния генотип (Federroz 67). Пръскането с CK може да стимулира свръхекспресията на цитокинин оксидаза/дехидрогеназа, като по този начин увеличава съдържанието на защитни съединения като бетаин и пролин (Liu et al., 2020). BR насърчава индуцирането на осмопротектанти като бетаин, захари и аминокиселини (включително свободен пролин), поддържайки клетъчния осмотичен баланс при много неблагоприятни условия на околната среда (Kothari and Lachowiec, 2021).
Индексът на стрес на културите (CSI) и индексът на относителна толерантност (RTI) се използват, за да се определи дали оценяваните третирания спомагат за смекчаване на различни стресове (абиотични и биотични) и имат положителен ефект върху физиологията на растенията (Castro-Duque et al., 2020; Chavez-Arias et al., 2020). Стойностите на CSI могат да варират от 0 до 1, представлявайки съответно нестресови и стресови условия (Lee et al., 2010). Стойностите на CSI на растенията, подложени на топлинен стрес (SC), варират от 0,8 до 0,9 (Фигура 2B), което показва, че оризовите растения са били негативно засегнати от комбиниран стрес. Листното пръскане с BC (0,6) или CK (0,6) обаче е довело главно до намаляване на този показател при условия на абиотичен стрес в сравнение с оризовите растения SC. При растения F2000, RTI показа по-голямо увеличение при използване на CA (97,69%) и BC (60,73%) в сравнение със SA (33,52%), което показва, че тези регулатори на растежа на растенията също допринасят за подобряване на реакцията на ориза към толерантността на състава. Прегряване. Тези индекси са предложени за управление на стресови условия при различни видове. Проучване, проведено от Lee et al. (2010), показа, че CSI на два сорта памук при умерен воден стрес е около 0,85, докато стойностите на CSI на добре напояваните сортове варират от 0,4 до 0,6, което заключава, че този индекс е индикатор за адаптацията на сортовете към водата към стресови условия. Освен това, Chavez-Arias et al. (2020) оцениха ефективността на синтетичните елиситори като цялостна стратегия за управление на стреса при растенията C. elegans и установиха, че растенията, пръскани с тези съединения, показват по-висок RTI (65%). Въз основа на гореизложеното, CK и BR могат да се разглеждат като агрономически стратегии, насочени към повишаване на толерантността на ориза към сложен топлинен стрес, тъй като тези регулатори на растежа на растенията индуцират положителни биохимични и физиологични реакции.
През последните няколко години изследванията на ориза в Колумбия се фокусираха върху оценката на генотипове, толерантни към високи дневни или нощни температури, използвайки физиологични или биохимични характеристики (Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2021). Въпреки това, през последните няколко години анализът на практични, икономични и печеливши технологии става все по-важен, за да се предложи интегрирано управление на културите за подобряване на ефектите от сложни периоди на топлинен стрес в страната (Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderon et al., 2021). По този начин, физиологичните и биохимичните реакции на оризовите растения към сложен топлинен стрес (40°C ден/30°C нощ), наблюдавани в това проучване, показват, че листното пръскане с CK или BR може да бъде подходящ метод за управление на културите за смекчаване на неблагоприятните ефекти. Ефект от периоди на умерен топлинен стрес. Тези обработки подобриха толерантността и на двата генотипа ориз (нисък CSI и висок RTI), демонстрирайки обща тенденция във физиологичните и биохимичните реакции на растенията при комбиниран топлинен стрес. Основната реакция на оризовите растения беше намаляване на съдържанието на GC, общ хлорофил, хлорофили α и β и каротеноиди. Освен това, растенията страдат от увреждане на PSII (намалени параметри на флуоресценция на хлорофила, като съотношение Fv/Fm) и повишена липидна пероксидация. От друга страна, когато оризът беше третиран с CK и BR, тези негативни ефекти бяха смекчени и съдържанието на пролин се увеличи (фиг. 4).
Фигура 4. Концептуален модел на ефектите от комбинирания топлинен стрес и листното пръскане с регулатор на растежа на растенията върху оризови растения. Червените и сините стрелки показват отрицателните или положителните ефекти от взаимодействието между топлинния стрес и листното приложение на BR (брасиностероид) и CK (цитокинин) върху физиологичните и биохимичните реакции, съответно. gs: устична проводимост; Total Chl: общо съдържание на хлорофил; Chl α: съдържание на хлорофил β; Cx+c: съдържание на каротеноиди;
В обобщение, физиологичните и биохимичните реакции в това проучване показват, че оризовите растения Fedearroz 2000 са по-податливи на период на сложен топлинен стрес, отколкото оризовите растения Fedearroz 67. Всички регулатори на растежа, оценени в това проучване (ауксини, гиберелини, цитокинини или брасиностероиди), демонстрираха известна степен на комбинирано намаляване на топлинния стрес. Цитокининът и брасиностероидите обаче индуцираха по-добра адаптация на растенията, тъй като и двата регулатора на растежа на растенията увеличиха съдържанието на хлорофил, параметрите на флуоресценция на алфа-хлорофила, gs и RWC в сравнение с оризовите растения без никакво приложение, а също така намалиха съдържанието на MDA и температурата на короната. В обобщение, заключаваме, че използването на регулатори на растежа на растенията (цитокинини и брасиностероиди) е полезен инструмент за управление на стресовите условия в оризовите култури, причинени от силен топлинен стрес по време на периоди на високи температури.
Оригиналните материали, представени в изследването, са включени в статията, а допълнителни запитвания могат да бъдат насочени към съответния автор.
Време на публикуване: 08.08.2024 г.