Растежът на апикалната меристема на леторастите (SAM) е критичен за архитектурата на стъблото. Растителни хормонигиберелини(GA) играят ключова роля в координирането на растежа на растенията, но тяхната роля в SAM остава слабо разбрана. Тук разработихме съотношителен биосензор на GA сигнализиране чрез инженерство на DELLA протеина, за да потисне неговата основна регулаторна функция в GA транскрипционния отговор, като същевременно запази разграждането му при GA разпознаване. Ние демонстрираме, че този базиран на разграждане биосензор точно записва промените в нивата на GA и клетъчното усещане по време на развитие. Използвахме този биосензор, за да картографираме GA сигнализиращата активност в SAM. Ние показваме, че високите GA сигнали присъстват предимно в клетки, разположени между примордиите на органи, които са предшественици на клетките на интернодите. Използвайки подходи за печалба и загуба на функция, ние допълнително демонстрираме, че GA регулира ориентацията на равнината на клетъчно делене, установявайки каноничната клетъчна организация на междувъзлията, като по този начин насърчава спецификацията на междувъзлията в SAM.
Апикалната меристема на издънката (SAM), разположена на върха на издънката, съдържа ниша от стволови клетки, чиято активност генерира странични органи и стволови възли по модулен и итеративен начин през целия живот на растението. Всяка от тези повтарящи се единици или растителни възли включва междувъзлия и странични органи във възлите и аксиларни меристеми в пазвите на листата1. Растежът и организацията на растителните възли се променят по време на развитието. При Arabidopsis междувъзловият растеж се потиска по време на вегетативния стадий и аксиларните меристеми остават латентни в пазвите на розетъчните листа. По време на прехода към цъфтежната фаза SAM се превръща в меристема на съцветието, генерирайки удължени междувъзлия и аксиларни пъпки, разклонения в пазвите на листата на стеблата и по-късно безлистни цветя2. Въпреки че постигнахме значителен напредък в разбирането на механизмите, които контролират инициирането на листата, цветята и клоните, сравнително малко се знае за това как възникват междувъзлията.
Разбирането на пространствено-времевото разпределение на ГА ще помогне да се разберат по-добре функциите на тези хормони в различни тъкани и на различни етапи на развитие. Визуализирането на разграждането на сливането на RGA-GFP, изразено под действието на неговия собствен промотор, предоставя важна информация за регулирането на общите нива на GA в корените 15, 16. Експресията на RGA обаче варира в различните тъкани17 и се регулира от GA18. По този начин диференциалната експресия на RGA промотора може да доведе до модела на флуоресценция, наблюдаван с RGA-GFP и следователно този метод не е количествен. Съвсем наскоро биоактивен флуоресцеин (Fl)-белязан GA19,20 разкри натрупването на GA в кореновия ендокортекс и регулирането на неговите клетъчни нива чрез GA транспорт. Наскоро сензорът GA FRET nlsGPS1 показа, че нивата на GA корелират с клетъчното удължаване в корените, нишките и тъмно израсналите хипокотили21. Въпреки това, както видяхме, концентрацията на GA не е единственият параметър, контролиращ сигналната активност на GA, тъй като зависи от сложни сензорни процеси. Тук, надграждайки нашето разбиране за DELLA и GA сигналните пътища, ние докладваме разработването и характеризирането на базиран на разграждане съотношен биосензор за GA сигнализиране. За да разработим този количествен биосензор, използвахме мутантен GA-чувствителен RGA, който беше слят с флуоресцентен протеин и повсеместно експресиран в тъканите, както и GA-нечувствителен флуоресцентен протеин. Ние показваме, че мутантните RGA протеинови сливания не пречат на ендогенното GA сигнализиране, когато се експресират повсеместно, и че този биосензор може да определи количествено сигнализиращата активност, произтичаща както от GA вход, така и от обработка на GA сигнал от сензорния апарат с висока пространствено-времева разделителна способност. Използвахме този биосензор, за да картографираме пространствено-времевото разпределение на сигналната активност на GA и да определим количествено как GA регулира клетъчното поведение в SAM епидермиса. Ние демонстрираме, че GA регулира ориентацията на равнината на делене на SAM клетките, разположени между органните примордии, като по този начин определя каноничната клетъчна организация на интернода.
И накрая, попитахме дали qmRGA може да докладва промени в ендогенните нива на GA, използвайки нарастващи хипокотили. По-рано показахме, че нитратът стимулира растежа чрез увеличаване на синтеза на GA и, от своя страна, разграждането на DELLA34. Съответно, ние наблюдавахме, че дължината на хипокотила в pUBQ10 :: qmRGA разсад, отгледан при обилно снабдяване с нитрати (10 mM NO3-), е значително по-дълъг от този в разсад, отгледан при условия на нитратен дефицит (допълнителна фигура 6а). В съответствие с отговора на растежа, GA сигналите са по-високи в хипокотили на разсад, отглеждани при условия на 10 mM NO3-, отколкото в разсад, отгледан в отсъствие на нитрат (допълнителна фигура 6b, c). По този начин qmRGA също позволява наблюдение на промените в сигнализирането на GA, предизвикано от ендогенни промени в концентрацията на GA.
За да разберем дали GA сигнализиращата активност, открита от qmRGA, зависи от концентрацията на GA и възприемането на GA, както се очаква въз основа на дизайна на сензора, ние анализирахме експресията на трите GID1 рецептора във вегетативни и репродуктивни тъкани. При разсад репортерната линия GID1-GUS показа, че GID1a и c са силно експресирани в котиледоните (Фиг. 3a-c). В допълнение, и трите рецептора се експресират в листата, страничните коренови примордии, върховете на корените (с изключение на кореновата капачка на GID1b) и съдовата система (фиг. 3a-c). В съцветието SAM открихме GUS сигнали само за GID1b и 1c (допълнителна фигура 7a-c). In situ хибридизацията потвърди тези модели на експресия и допълнително демонстрира, че GID1c е равномерно експресиран при ниски нива в SAM, докато GID1b показва по-висока експресия в периферията на SAM (допълнителна фигура 7d-l). Транслационното сливане на pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b също разкрива степенуван диапазон на експресия на GID1b, от ниска или никаква експресия в центъра на SAM до висока експресия в границите на органа (допълнителна фигура 7m). По този начин GID1 рецепторите не са равномерно разпределени в и в тъканите. В последващи експерименти ние също наблюдавахме, че свръхекспресията на GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) повишава чувствителността на qmRGA в хипокотилите към външно приложение на GA (фиг. 3d, e). Обратно, флуоресценцията, измерена чрез qd17mRGA в хипокотила, е нечувствителна към третиране с GA3 (фиг. 3f, g). И за двата анализа, разсадът беше третиран с високи концентрации на GA (100 μM GA3), за да се оцени бързото поведение на сензора, където способността за свързване с GID1 рецептора беше повишена или загубена. Заедно тези резултати потвърждават, че биосензорът qmRGA изпълнява комбинирана функция като GA и GA сензор и предполагат, че диференциалната експресия на GID1 рецептора може значително да модулира излъчвателната способност на сензора.
Към днешна дата разпределението на GA сигналите в SAM остава неясно. Затова използвахме qmRGA-експресиращи растения и pCLV3 :: mCherry-NLS репортера на стволови клетки35, за да изчислим количествени карти с висока разделителна способност на GA сигнализираща активност, фокусирайки се върху слоя L1 (епидермис; Фиг. 4a, b, вижте Методи и допълнителни методи), тъй като L1 играе ключова роля в контролирането на растежа на SAM36. Тук експресията на pCLV3 :: mCherry-NLS предостави фиксирана геометрична референтна точка за анализиране на пространствено-времевото разпределение на GA сигнализиращата активност37. Въпреки че GA се счита за съществено за развитието на страничните органи4, ние наблюдавахме, че GA сигналите са ниски във флоралния примордиум (P), започвайки от етап P3 (Фиг. 4a, b), докато младите P1 и P2 примордиуми имат умерена активност, подобна на тази в централния регион (Фиг. 4a, b). По-висока GA сигнална активност беше открита в границите на примордиума на органа, започвайки от P1/P2 (отстрани на границата) и достигайки пик при P4, както и във всички клетки на периферната област, разположена между примордиите (Фиг. 4a, b и Допълнителна Фигура 8a, b). Тази по-висока GA сигнална активност се наблюдава не само в епидермиса, но и в L2 и горните L3 слоеве (допълнителна фигура 8b). Моделът на GA сигнали, открити в SAM с помощта на qmRGA, също остава непроменен с течение на времето (допълнителна фигура 8c–f, k). Въпреки че конструкцията qd17mRGA беше систематично понижена в SAM на T3 растения от пет независими линии, които характеризирахме подробно, ние успяхме да анализираме моделите на флуоресценция, получени с конструкцията pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP (допълнителна фигура 8g–j, l). В тази контролна линия бяха открити само незначителни промени в съотношението на флуоресценция в SAM, но в центъра на SAM наблюдавахме ясно и неочаквано намаляване на VENUS, свързано с TagBFP. Това потвърждава, че сигналният модел, наблюдаван от qmRGA, отразява GA-зависима деградация на mRGA-VENUS, но също така показва, че qmRGA може да надценява GA сигнализиращата активност в меристемния център. В обобщение, нашите резултати разкриват GA сигнален модел, който отразява основно разпределението на примордиите. Това разпределение на интер-примордиалния регион (IPR) се дължи на постепенното установяване на висока GA сигнална активност между развиващия се примордиум и централния регион, докато в същото време GA сигнализиращата активност в примордиума намалява (фиг. 4c, d).
Разпределението на GID1b и GID1c рецепторите (вижте по-горе) предполага, че диференциалната експресия на GA рецепторите помага за оформянето на модела на GA сигнализираща активност в SAM. Чудехме се дали може да има различно натрупване на GA. За да проучим тази възможност, използвахме сензора nlsGPS1 GA FRET21. Повишена честота на активиране беше открита в SAM на nlsGPS1, третиран с 10 μM GA4 +7 за 100 минути (допълнителна фигура 9a–e), което показва, че nlsGPS1 реагира на промените в концентрацията на GA в SAM, както прави в корените21. Пространственото разпределение на честотата на активиране на nlsGPS1 разкри сравнително ниски нива на GA във външните слоеве на SAM, но показа, че те са повишени в центъра и на границите на SAM (фиг. 4e и допълнителна фигура 9a, c). Това предполага, че GA също се разпространява в SAM с пространствен модел, сравним с този, разкрит от qmRGA. Като допълнителен подход, ние също третирахме SAM с флуоресцентен GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или Fl самостоятелно като отрицателна контрола. Сигналът Fl беше разпределен в целия SAM, включително централната област и примордиума, макар и с по-нисък интензитет (фиг. 4j и допълнителна фигура 10d). За разлика от това, и трите GA-Fl се натрупват специално в границите на примордиума и в различна степен в останалата част от IPR, като GA7-Fl се натрупва в най-големия домейн в IPR (фиг. 4k и допълнителна фигура 10a, b). Количественото определяне на интензитета на флуоресценция разкрива, че съотношението на интензитета на IPR към не-IPR е по-високо в SAM, третиран с GA-Fl, в сравнение с SAM, третиран с Fl (Фиг. 4l и Допълнителна Фигура 10c). Заедно тези резултати предполагат, че GA присъства в по-високи концентрации в IPR клетки, които са разположени най-близо до границата на органа. Това предполага, че моделът на SAM GA сигнализираща активност е резултат както от диференциална експресия на GA рецептори, така и от диференциално натрупване на GA в IPR клетки близо до границите на органи. По този начин нашият анализ разкри неочакван пространствено-времеви модел на GA сигнализиране, с по-ниска активност в центъра и примордиума на SAM и по-висока активност в IPR в периферния регион.
За да разберем ролята на диференциалната GA сигнална активност в SAM, ние анализирахме корелацията между GA сигнализиращата активност, клетъчната експанзия и клетъчното делене, използвайки изобразяване в реално време на SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Като се има предвид ролята на GA в регулирането на растежа, се очаква положителна корелация с параметрите на клетъчната експанзия. Затова първо сравнихме картите на сигналната активност на GA с карти на скоростта на растеж на клетъчната повърхност (като прокси за силата на клетъчното разширяване за дадена клетка и за дъщерните клетки при делене) и с карти на анизотропията на растежа, която измерва насочеността на клетъчното разширяване (също използвано тук за дадена клетка и за дъщерни клетки при делене; Фиг. 5a, b, вижте Методи и допълнителни методи). Нашите карти на скоростта на растеж на клетъчната повърхност на SAM са в съответствие с предишни наблюдения 38, 39, с минимални темпове на растеж на границата и максимални темпове на растеж в развиващите се цветя (фиг. 5а). Анализът на главния компонент (PCA) показа, че сигналната активност на GA е отрицателно корелирана с интензитета на растеж на клетъчната повърхност (Фигура 5с). Ние също така показахме, че основните оси на вариация, включително GA сигнален вход и интензитет на растеж, са ортогонални на посоката, определена от високата експресия на CLV3, потвърждавайки изключването на клетки от центъра на SAM в останалите анализи. Корелационният анализ на Spearman потвърждава резултатите от PCA (Фигура 5d), показвайки, че по-високите GA сигнали в IPR не водят до по-висока клетъчна експанзия. Въпреки това, корелационният анализ разкрива лека положителна корелация между GA сигнализиращата активност и анизотропията на растежа (Фигура 5c, d), което предполага, че по-високото GA сигнализиране в IPR влияе върху посоката на клетъчния растеж и вероятно позицията на равнината на клетъчно делене.
a, b Топлинни карти на средния повърхностен растеж (a) и анизотропията на растежа (b) в SAM, осреднени за седем независими растения (използвани съответно като показатели за силата и посоката на клетъчното разширяване). c PCA анализът включва следните променливи: GA сигнал, интензитет на повърхностния растеж, анизотропия на повърхностния растеж и експресия на CLV3. PCA компонент 1 е основно отрицателно корелиран с интензитета на повърхностния растеж и положително корелиран с GA сигнала. PCA компонент 2 е основно положително корелиран с анизотропията на повърхностния растеж и отрицателно корелиран с експресията на CLV3. Процентите представляват вариацията, обяснена от всеки компонент. d Корелационен анализ на Spearman между GA сигнала, интензитета на повърхностния растеж и анизотропията на повърхностния растеж в тъканния мащаб, с изключение на CZ. Числото вдясно е rho стойността на Spearman между две променливи. Звездичките показват случаи, в които корелацията/отрицателната корелация е силно значима. e 3D визуализация на Col-0 SAM L1 клетки чрез конфокална микроскопия. Новите клетъчни стени, образувани в SAM (но не и в примордиума) на 10 часа, са оцветени според техните ъглови стойности. Цветната лента е показана в долния десен ъгъл. Вложката показва съответното 3D изображение в 0 h. Експериментът е повторен два пъти с подобни резултати. f Диаграмите в кутия показват скоростите на клетъчно делене в IPR и не-IPR Col-0 SAM (n = 10 независими растения). Централната линия показва медианата, а границите на кутията показват 25-ия и 75-ия персентил. Мустаците показват минималните и максималните стойности, определени с R софтуер. P стойностите са получени с двустранния t-тест на Уелч. g, h Схематична диаграма, показваща (g) как да се измери ъгълът на новата клетъчна стена (магента) спрямо радиалната посока от центъра на SAM (бяла пунктирана линия) (разглеждат се само стойности на острите ъгли, т.е. 0–90°), и (h) периферните/страничните и радиалните посоки в меристемата. i Честотни хистограми на ориентацията на равнината на клетъчното делене в SAM (тъмносиньо), IPR (средно синьо) и не-IPR (светлосиньо), съответно. P-стойностите бяха получени чрез двустранен тест на Колмогоров-Смирнов. Експериментът беше повторен два пъти с подобни резултати. j Честотни хистограми на ориентацията на равнината на клетъчното делене на IPR около P3 (светлозелено), P4 (среднозелено) и P5 (тъмнозелено), съответно. P-стойностите бяха получени чрез двустранен тест на Колмогоров-Смирнов. Експериментът беше повторен два пъти с подобни резултати.
Следователно, след това изследвахме корелацията между GA сигнализирането и активността на клетъчното делене чрез идентифициране на новообразувани клетъчни стени по време на анализа (фиг. 5е). Този подход ни позволи да измерим честотата и посоката на делене на клетките. Изненадващо, ние открихме, че честотата на клетъчните деления в IPR и останалата част от SAM (не-IPR, Фиг. 5f) е подобна, което показва, че разликите в GA сигнализирането между IPR и не-IPR клетките не влияят значително на клетъчното делене. Това и положителната корелация между GA сигнализирането и анизотропията на растежа ни подтикнаха да обмислим дали GA сигнализиращата активност може да повлияе на ориентацията на равнината на клетъчно делене. Измерихме ориентацията на новата клетъчна стена като остър ъгъл спрямо радиалната ос, свързваща центъра на меристема и центъра на новата клетъчна стена (фиг. 5e-i) и наблюдавахме ясна тенденция клетките да се делят под ъгли, близки до 90° спрямо радиалната ос, като най-високите честоти се наблюдават при 70–80° (23,28%) и 80–90° (22.62%) (фиг. 5e, i), съответстващи на клетъчните деления в периферна/напречна посока (фиг. 5h). За да изследваме приноса на GA сигнализирането към това поведение на клетъчното делене, ние анализирахме параметрите на клетъчното делене в IPR и не-IPR поотделно (фиг. 5i). Ние наблюдавахме, че разпределението на ъгъла на делене в IPR клетките се различава от това в не-IPR клетките или в клетките в целия SAM, като IPR клетките показват по-висок дял от странични/кръгови клетъчни деления, т.е. 70–80 ° и 80–90 ° (33,86% и 30,71%, съответно, съответни пропорции) (фиг. 5i). По този начин, нашите наблюдения разкриха връзка между високото GA сигнализиране и ориентацията на равнината на клетъчно делене близо до периферната посока, подобно на корелацията между GA сигнализиращата активност и анизотропията на растежа (фиг. 5c, d). За по-нататъшно установяване на пространственото запазване на тази асоциация, ние измерихме ориентацията на равнината на разделяне в IPR клетките, заобикалящи примордиума, започвайки от P3, тъй като най-високата GA сигнална активност беше открита в този регион, започвайки от P4 (фиг. 4). Ъглите на разделяне на IPR около P3 и P4 не показват статистически значими разлики, въпреки че се наблюдава повишена честота на странични клетъчни деления в IPR около P4 (фиг. 5j). Въпреки това, в IPR клетките около P5, разликата в ориентацията на равнината на клетъчно делене стана статистически значима, с рязко увеличение на честотата на напречните клетъчни деления (фиг. 5j). Заедно тези резултати предполагат, че GA сигнализирането може да контролира ориентацията на клетъчните деления в SAM, което е в съответствие с предишни доклади 40, 41, че високото GA сигнализиране може да предизвика странична ориентация на клетъчните деления в IPR.
Предвижда се, че клетките в IPR няма да бъдат включени в примордии, а по-скоро в междувъзлия 2, 42, 43. Напречната ориентация на клетъчните деления в IPR може да доведе до типичната организация на успоредни надлъжни редове от епидермални клетки в междувъзлията. Нашите наблюдения, описани по-горе, предполагат, че сигнализирането на GA вероятно играе роля в този процес чрез регулиране на посоката на клетъчно делене.
Загубата на функция на няколко DELLA гена води до конститутивен GA отговор и della мутанти могат да се използват за тестване на тази хипотеза44. Първо анализирахме моделите на експресия на пет DELLA гена в SAM. Транскрипционното сливане на линията GUS45 разкрива, че GAI, RGA, RGL1 и RGL2 (в много по-малка степен) са експресирани в SAM (допълнителна фигура 11a-d). In situ хибридизацията допълнително демонстрира, че GAI mRNA се натрупва специфично в примордии и развиващи се цветя (допълнителна фигура 11e). RGL1 и RGL3 mRNA бяха открити в целия SAM балдахин и в по-стари цветя, докато RGL2 mRNA беше по-изобилна в граничния регион (допълнителна фигура 11f-h). Конфокалното изобразяване на pRGL3 :: RGL3-GFP SAM потвърди експресията, наблюдавана чрез in situ хибридизация и показа, че протеинът RGL3 се натрупва в централната част на SAM (допълнителна фигура 11i). Използвайки линията pRGA :: GFP-RGA, ние също открихме, че RGA протеинът се натрупва в SAM, но неговото изобилие намалява на границата, започвайки от P4 (допълнителна фигура 11j). Трябва да се отбележи, че моделите на експресия на RGL3 и RGA са в съответствие с по-висока GA сигнална активност в IPR, както е открито от qmRGA (фиг. 4). Освен това, тези данни показват, че всички DELLA са изразени в SAM и че тяхното изразяване колективно обхваща целия SAM.
След това анализирахме параметрите на клетъчното делене в SAM от див тип (Ler, контрола) и gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della петорни (глобални) мутанти (фиг. 6a, b). Интересно е, че наблюдаваме статистически значима промяна в разпределението на честотите на ъгъла на клетъчно делене в della global мутант SAM в сравнение с дивия тип (фиг. 6c). Тази промяна в глобалния мутант della се дължи на увеличаване на честотата на 80–90° ъгли (34,71% срещу 24,55%) и, в по-малка степен, 70–80° ъгли (23,78% срещу 20,18%), т.е. съответстващи на напречните клетъчни деления (фиг. 6c). Честотата на ненапречните деления (0–60 °) също е по-ниска в della global мутант (фиг. 6c). Честотата на напречните клетъчни деления беше значително повишена в SAM на della global мутант (фиг. 6b). Честотата на напречните клетъчни деления в IPR също е по-висока в della global мутант в сравнение с дивия тип (фиг. 6d). Извън областта на IPR, дивият тип има по-равномерно разпределение на ъглите на клетъчно делене, докато глобалният мутант della предпочита тангенциални деления като IPR (фиг. 6e). Ние също така определихме количествено ориентацията на клетъчните деления в SAM на ga2 оксидаза (ga2ox) петорни мутанти (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), GA-неактивен мутантен фон, в който GA се натрупва. В съответствие с повишаването на нивата на GA, SAM на петорното ga2ox мутантно съцветие беше по-голямо от това на Col-0 (допълнителна фигура 12a, b) и в сравнение с Col-0, петорното ga2ox SAM показа ясно различно разпределение на ъглите на клетъчно делене, като честотата на ъгъла нараства от 50° до 90°, т.е. отново в полза на тангенциални деления (допълнителна фигура 12a-c). По този начин, ние показваме, че конститутивното активиране на GA сигнализирането и натрупването на GA индуцират странични клетъчни деления в IPR и останалата част от SAM.
a, b 3D визуализация на L1 слой на PI-оцветен Ler (a) и глобален дела мутант (b) SAM с помощта на конфокална микроскопия. Новите клетъчни стени, образувани в SAM (но не и примордиума) за период от 10 часа, са показани и оцветени според техните ъглови стойности. Вмъкването показва SAM в 0 h. Цветната лента се показва в долния десен ъгъл. Стрелката в (b) сочи към пример за подравнени клетъчни файлове в глобалния della mutant. Експериментът беше повторен два пъти с подобни резултати. сравнение на честотното разпределение на ориентациите на равнината на клетъчно делене в целия SAM (d), IPR (e) и не-IPR (f) между Ler и глобалната дела. P стойностите са получени с помощта на двустранен тест на Колмогоров-Смирнов. f, g 3D визуализация на конфокални изображения на PI-оцветени SAM на Col-0 (i) и pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) трансгенни растения. Панелите (a, b) показват нови клетъчни стени (но не и примордии), образувани в SAM в рамките на 10 часа. Експериментът беше повторен два пъти с подобни резултати. h–j Сравнение на честотното разпределение на ориентациите на равнината на клетъчно делене, разположени в целия SAM (h), IPR (i) и не-IPR (j) между Col-0 и pCUC2 :: gai-1-VENUS растения. P стойностите са получени с помощта на двустранен тест на Колмогоров-Смирнов.
След това тествахме ефекта от инхибирането на GA сигнализиране конкретно в IPR. За тази цел използвахме промотора на котиледона чаша 2 (CUC2), за да задвижим експресията на доминиращ отрицателен gai-1 протеин, слят с VENUS (в линията pCUC2::gai-1-VENUS). В дивия тип SAM, CUC2 промоторът управлява експресията на повечето IPRs в SAM, включително гранични клетки, от P4 нататък, и подобна специфична експресия се наблюдава в pCUC2::gai-1-VENUS растения (вижте по-долу). Разпределението на ъглите на клетъчно делене в SAM или IPR на pCUC2 :: gai-1-VENUS растения не се различава значително от това на дивия тип, въпреки че неочаквано открихме, че клетките без IPR в тези растения се разделят при по-висока честота от 80–90 ° (фиг. 6f–j).
Предполага се, че посоката на делене на клетките зависи от геометрията на SAM, по-специално напрежението на опън, генерирано от извивката на тъканта46. Затова попитахме дали формата на SAM е променена в растенията della global мутант и pCUC2 :: gai-1-VENUS. Както беше съобщено по-рано 12, размерът на della global мутант SAM беше по-голям от този на дивия тип (допълнителна фигура 13a, b, d). In situ хибридизация на CLV3 и STM РНК потвърди разширяването на меристема в della мутанти и допълнително показа страничното разширяване на нишата на стволовите клетки (допълнителна фигура 13e, f, h, i). Въпреки това, кривината на SAM е сходна и в двата генотипа (допълнителна фигура 13k, m, n, p). Наблюдавахме подобно увеличение на размера в gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della четворен мутант без промяна в кривината в сравнение с дивия тип (допълнителна фигура 13c, d, g, j, l, o, p). Честотата на ориентацията на клетъчното делене също беше засегната в делла четворния мутант, но в по-малка степен, отколкото в дела монолитния мутант (допълнителна фигура 12d-f). Този ефект на дозиране, заедно с липсата на ефект върху кривината, предполага, че остатъчната активност на RGL3 в четворния мутант на Della ограничава промените в ориентацията на клетъчното делене, причинени от загуба на активност на DELLA и че промените в страничните клетъчни деления възникват в отговор на промени в сигналната активност на GA, а не промени в геометрията на SAM. Както е описано по-горе, CUC2 промоторът управлява експресията на IPR в SAM, започвайки от P4 (допълнителна фигура 14a, b), и за разлика от него, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM има намален размер, но по-висока кривина (допълнителна фигура 14c–h). Тази промяна в морфологията на pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM може да доведе до различно разпределение на механичните напрежения в сравнение с дивия тип, при който високите периферни напрежения започват на по-късо разстояние от центъра на SAM47. Алтернативно, промените в морфологията на pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM могат да бъдат резултат от промени в регионалните механични свойства, индуцирани от трансгенна експресия48. И в двата случая това може частично да компенсира ефектите от промените в сигнализирането на GA чрез увеличаване на вероятността клетките да се разделят в периферна/напречна ориентация, обяснявайки нашите наблюдения.
Взети заедно, нашите данни потвърждават, че по-високото GA сигнализиране играе активна роля в страничната ориентация на равнината на клетъчно делене в IPR. Те също така показват, че кривината на меристема също влияе върху ориентацията на равнината на клетъчно делене в IPR.
Напречната ориентация на равнината на разделяне в IPR, поради високата GA сигнална активност, предполага, че GA предварително организира радиален клетъчен файл в епидермиса в рамките на SAM, за да определи клетъчната организация, която по-късно ще бъде открита в епидермалното междувъзлие. Наистина, такива клетъчни файлове често се виждат в SAM изображения на della global мутанти (фиг. 6b). По този начин, за по-нататъшно изследване на функцията на развитие на пространствения модел на GA сигнализиране в SAM, ние използвахме изображения с изтичане на времето, за да анализираме пространствената организация на клетките в IPR в див тип (Ler и Col-0), della глобални мутанти и pCUC2 :: gai-1-VENUS трансгенни растения.
Ние открихме, че qmRGA показа, че GA сигнализиращата активност в IPR се увеличава от P1/P2 и достига своя връх при P4, и този модел остава постоянен във времето (Фиг. 4a-f и Допълнителна Фигура 8c-f, k). За да анализираме пространствената организация на клетките в IPR с нарастващ GA сигнал, ние маркирахме Ler IPR клетки отгоре и отстрани на P4 според тяхната съдба на развитие, анализирана 34 часа след първото наблюдение, т.е. повече от два пластидни пъти, което ни позволява да следваме IPR клетки по време на развитието на примордиум от P1/P2 до P4. Използвахме три различни цвята: жълто за тези клетки, които бяха интегрирани в примордиума близо до P4, зелено за тези, които бяха в IPR, и лилаво за тези, които участваха и в двата процеса (фиг. 7a-c). При t0 (0 h), 1–2 слоя IPR клетки се виждат пред P4 (фиг. 7а). Както се очакваше, когато тези клетки се разделиха, те го направиха главно чрез напречната равнина на делене (фиг. 7a-c). Подобни резултати бяха получени при използване на Col-0 SAM (фокусиран върху P3, чиято граница се сгъва подобно на P4 в Ler), въпреки че в този генотип гънката, образувана на флоралната граница, скри IPR клетките по-бързо (фиг. 7g-i). По този начин моделът на разделяне на IPR клетките предварително организира клетките в радиални редове, както в междувъзлията. Организацията на радиалните редове и локализирането на IPR клетки между последователни органи предполагат, че тези клетки са интернодални предшественици.
Тук разработихме съотношен GA сигнализиращ биосензор, qmRGA, който позволява количествено картографиране на GA сигнализираща активност в резултат на комбинирани концентрации на GA и GA рецептор, като същевременно минимизира намесата в ендогенните сигнални пътища, като по този начин предоставя информация за функцията на GA на клетъчно ниво. За тази цел, ние конструирахме модифициран DELLA протеин, mRGA, който е загубил способността да свързва DELLA партньори за взаимодействие, но остава чувствителен към GA-индуцирана протеолиза. qmRGA реагира както на екзогенни, така и на ендогенни промени в нивата на GA и неговите динамични сензорни свойства позволяват оценка на пространствено-времеви промени в сигналната активност на GA по време на развитие. qmRGA също е много гъвкав инструмент, тъй като може да бъде адаптиран към различни тъкани чрез промяна на промотора, използван за неговата експресия (ако е необходимо), и като се има предвид запазената природа на GA сигналния път и PFYRE мотива в покритосеменни растения, е вероятно да бъде прехвърлен на други видове22. В съответствие с това е показано също, че еквивалентна мутация в оризовия SLR1 DELLA протеин (HYY497AAA) потиска растежната репресорна активност на SLR1, като същевременно само леко намалява неговото GA-медиирано разграждане, подобно на mRGA23. По-специално, скорошни проучвания в Arabidopsis показаха, че една аминокиселинна мутация в PFYRE домейна (S474L) променя транскрипционната активност на RGA, без да засяга способността му да взаимодейства с партньори на транскрипционния фактор50. Въпреки че тази мутация е много близка до 3-те аминокиселинни замествания, присъстващи в mRGA, нашите проучвания показват, че тези две мутации променят различни характеристики на DELLA. Въпреки че повечето партньори на транскрипционния фактор се свързват с LHR1 и SAW домейните на DELLA26, 51, някои запазени аминокиселини в PFYRE домейна могат да помогнат за стабилизирането на тези взаимодействия.
Развитието на междувъзлията е ключова характеристика в архитектурата на растението и подобряването на добива. qmRGA разкри по-висока GA сигнална активност в IPR интернодни прогениторни клетки. Чрез комбиниране на количествено изобразяване и генетика, ние показахме, че моделите на сигнализиране на GA наслагват кръгови/напречни равнини на клетъчно делене в SAM епидермиса, оформяйки организацията на клетъчното делене, необходима за развитието на междувъзлията. Няколко регулатора на ориентацията на равнината на клетъчно делене са идентифицирани по време на разработката52,53. Нашата работа предоставя ясен пример за това как сигналната активност на GA регулира този клетъчен параметър. DELLA може да взаимодейства с предварително нагъващи се протеинови комплекси41, така че GA сигнализирането може да регулира ориентацията на равнината на клетъчно делене чрез директно влияние върху ориентацията на кортикалните микротубули40,41,54,55. Ние неочаквано показахме, че в SAM, корелът на по-високата GA сигнална активност не е клетъчно удължаване или делене, а само анизотропия на растежа, което е в съответствие с директния ефект на GA върху посоката на клетъчното делене в IPR. Не можем обаче да изключим, че този ефект може да бъде и индиректен, например медииран от индуцирано от GA омекване на клетъчната стена56. Промените в свойствата на клетъчната стена предизвикват механичен стрес 57, 58, който също може да повлияе на ориентацията на равнината на клетъчно делене, като повлияе на ориентацията на кортикалните микротубули 39, 46, 59. Комбинираните ефекти на индуцирания от GA механичен стрес и директното регулиране на ориентацията на микротубулите от GA могат да бъдат включени в генерирането на специфичен модел на ориентация на клетъчното делене в IPR за определяне на междувъзлия и са необходими допълнителни проучвания, за да се тества тази идея. По същия начин, предишни проучвания подчертаха значението на DELLA-взаимодействащите протеини TCP14 и 15 в контрола на образуването на междувъзлия 60, 61 и тези фактори могат да медиират действието на GA заедно с BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), които регулират развитието на междувъзлията и е доказано, че влияят на GA сигнализирането 2, 62. Като се има предвид, че DELLA взаимодействат с брасиностероиди, етилен, жасмонова киселина и абсцизова киселина (ABA) сигнални пътища 63, 64 и че тези хормони могат да повлияят на ориентацията на микротубулите 65, ефектите на GA върху ориентацията на клетъчното делене могат също да бъдат медиирани от други хормони.
Ранните цитологични изследвания показват, че както вътрешните, така и външните региони на Arabidopsis SAM са необходими за развитието на междувъзлията 2, 42. Фактът, че GA активно регулира клетъчното делене във вътрешните тъкани12, подкрепя двойната функция на GA при регулиране на размера на меристема и междувъзлия в SAM. Моделът на насочено клетъчно делене също е строго регулиран във вътрешната SAM тъкан и тази регулация е от съществено значение за растежа на стъблото52. Ще бъде интересно да се проучи дали GA също играе роля в ориентирането на равнината на клетъчно делене във вътрешната SAM организация, като по този начин синхронизира спецификацията и развитието на интернодите в SAM.
Растенията се отглеждат in vitro в почва или 1x среда Murashige-Skoog (MS) (Duchefa), допълнена с 1% захароза и 1% агар (Sigma) при стандартни условия (16 часа светлина, 22 °C), с изключение на експерименти за растеж на хипокотил и корен, при които разсадът се отглежда на вертикални плочи при постоянна светлина и 22 °C. За експерименти с нитрати растенията се отглеждат върху модифицирана MS среда (растителна среда bioWORLD), допълнена с подходящ нитрат (0 или 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-сукцинат, 1% захароза и 1% А-агар (Sigma) при условия на дълъг ден.
GID1a cDNA, вмъкната в pDONR221, беше рекомбинирана с pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry в pB7m34GW за генериране на pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 ДНК, вмъкната в pDONR221, беше рекомбинирана в pB7RWG266 за генериране на p35S:IDD2-RFP. За генериране на pGID1b::2xmTQ2-GID1b, 3,9 kb фрагмент нагоре от GID1b кодиращия регион и 4,7 kb фрагмент, съдържащ GID1b cDNA (1,3 kb) и терминатор (3,4 kb) първо бяха амплифицирани с помощта на праймерите в допълнителна таблица 3 и след това вмъкнати в pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), съответно, и накрая рекомбиниран с pDONR221 2xmTQ268 в pGreen 012567 целеви вектор, използвайки клониране на Gateway. За генериране на pCUC2::LSSmOrange, CUC2 промоторната последователност (3229 bp нагоре по веригата на ATG), последвана от кодиращата последователност на голям Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 с N7 сигнал за ядрена локализация и NOS транскрипционен терминатор бяха сглобени в pGreen канамицин насочен вектор, използвайки Gateway 3-фрагментна рекомбинационна система (Invitrogen). Растителният бинарен вектор беше въведен в Agrobacterium tumefaciens щам GV3101 и въведен в листата на Nicotiana benthamiana чрез метод на инфилтрация на Agrobacterium и в Arabidopsis thaliana Col-0 съответно чрез метод на флорално потапяне. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA бяха изолирани съответно от F3 и F1 потомствата на съответните кръстоски.
РНК in situ хибридизация се извършва върху приблизително 1 cm дълги върхове на издънки72, които се събират и незабавно фиксират в разтвор на FAA (3, 7% формалдехид, 5% оцетна киселина, 50% етанол), предварително охладен до 4 ° С. След 2 × 15 минути вакуумни обработки, фиксаторът беше сменен и пробите бяха инкубирани за една нощ. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3 cDNAs и антисенс сонди към техните 3'-UTRs бяха синтезирани с помощта на праймерите, показани в допълнителна таблица 3, както е описано от Rosier et al.73. Белязаните с дигоксигенин сонди бяха имунооткрити с помощта на дигоксигенинови антитела (3000-кратно разреждане; Roche, каталожен номер: 11 093 274 910) и срезовете бяха оцветени с 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP, 250-кратно разреждане)/нитросин тетразол (NBT, 200-кратно разреждане) разтвор.
Време на публикуване: 10 февруари 2025 г