Растежът на апикалната меристема (SAM) на леторастите е от решаващо значение за архитектурата на стъблото. Растителни хормонигиберелини(ГА) играят ключова роля в координирането на растежа на растенията, но тяхната роля в SAM остава слабо проучена. Тук разработихме ратиометрични биосензор за ГА сигнализация, като проектирахме PE протеина, за да потиснем неговата основна регулаторна функция в транскрипционния отговор на ГА, като същевременно запазим неговото разграждане при разпознаване на ГА. Демонстрираме, че този биосензор, базиран на разграждане, точно регистрира промените в нивата на ГА и клетъчното усещане по време на развитието. Използвахме този биосензор, за да картографираме ГА сигналната активност в SAM. Показваме, че високите ГА сигнали присъстват предимно в клетки, разположени между органните зачатъци, които са предшественици на междувъзалните клетки. Използвайки подходи за усилване и загуба на функция, ние допълнително демонстрираме, че ГА регулира ориентацията на равнината на клетъчното делене, установявайки каноничната клетъчна организация на междувъзлията, като по този начин насърчава спецификацията на междувъзлията в SAM.
Апикалната меристема на леторастя (SAM), разположена на върха на леторастя, съдържа ниша от стволови клетки, чиято активност генерира странични органи и стволови възли по модулен и итеративен начин през целия живот на растението. Всяка от тези повтарящи се единици или растителни възли включва междувъзлия и странични органи във възлите, както и аксиларни меристеми в пазвите на листата1. Растежът и организацията на растителните възли се променят по време на развитието. При Arabidopsis, междувъзлият растеж е потиснат по време на вегетативния етап, а аксиларните меристеми остават латентни в пазвите на розетковите листа. По време на прехода към флоралната фаза, SAM се превръща в съцветна меристема, генерирайки удължени междувъзлия и аксиларни пъпки, клонки в пазвите на стъбловите листа и по-късно безлистни цветове2. Въпреки че сме постигнали значителен напредък в разбирането на механизмите, които контролират образуването на листа, цветове и клони, сравнително малко се знае за това как възникват междувъзлията.
Разбирането на пространствено-времевото разпределение на GAs ще помогне за по-доброто разбиране на функциите на тези хормони в различни тъкани и на различни етапи от развитието. Визуализацията на разграждането на RGA-GFP сливането, експресирано под действието на собствения му промотор, предоставя важна информация за регулирането на общите нива на GA в корените15,16. Експресията на RGA обаче варира в различните тъкани17 и се регулира от GA18. По този начин, диференциалната експресия на RGA промотора може да доведе до флуоресцентния модел, наблюдаван с RGA-GFP, и следователно този метод не е количествен. Съвсем наскоро, биоактивен флуоресцеин (Fl)-маркиран GA19,20 разкри натрупването на GA в кореновия ендокортекс и регулирането на клетъчните му нива чрез GA транспорт. Наскоро GA FRET сензорът nlsGPS1 показа, че нивата на GA корелират с удължаването на клетките в корените, нишките и тъмно отглежданите хипокотили21. Както видяхме обаче, концентрацията на GA не е единственият параметър, контролиращ GA сигналната активност, тъй като зависи от сложни сензорни процеси. Тук, надграждайки нашето разбиране за сигналните пътища на PE и GA, ние докладваме за разработването и характеризирането на базиран на деградация ратиометричен биосензор за GA сигнализация. За да разработим този количествен биосензор, използвахме мутантна GA-чувствителна RGA, която беше слята с флуоресцентен протеин и повсеместно експресирана в тъканите, както и GA-нечувствителен флуоресцентен протеин. Показваме, че сливанията на мутантни RGA протеини не пречат на ендогенната GA сигнализация, когато са повсеместно експресирани, и че този биосензор може да определи количествено сигналната активност, резултат както от GA входа, така и от обработката на GA сигнала от сензорния апарат с висока пространствено-времева резолюция. Използвахме този биосензор, за да картографираме пространствено-времевото разпределение на GA сигналната активност и да определим количествено как GA регулира клетъчното поведение в епидермиса на SAM. Демонстрираме, че GA регулира ориентацията на равнината на делене на SAM клетките, разположени между органните зачатъци, като по този начин определя каноничната клетъчна организация на междувъзлия.
Накрая, попитахме дали qmRGA може да докладва промени в ендогенните нива на GA, използвайки растящи хипокотили. По-рано показахме, че нитратите стимулират растежа чрез увеличаване на синтеза на GA и, от своя страна, разграждането на PE34. Съответно, наблюдавахме, че дължината на хипокотила в разсади pUBQ10::qmRGA, отглеждани при обилно снабдяване с нитрати (10 mM NO3−), е значително по-дълга от тази в разсади, отглеждани при условия на дефицит на нитрати (Допълнителна фигура 6а). В съответствие с растежния отговор, GA сигналите са по-високи в хипокотилите на разсади, отглеждани при условия на 10 mM NO3−, отколкото в разсади, отглеждани при липса на нитрати (Допълнителна фигура 6b, c). По този начин, qmRGA също така позволява наблюдение на промените в GA сигнализацията, предизвикани от ендогенни промени в концентрацията на GA.
За да разберем дали GA сигналната активност, открита от qmRGA, зависи от концентрацията на GA и възприятието на GA, както се очаква въз основа на дизайна на сензора, анализирахме експресията на трите GID1 рецептора във вегетативни и репродуктивни тъкани. При разсад, GID1-GUS репортерната линия показа, че GID1a и c са силно експресирани в котиледоните (фиг. 3a-c). Освен това, и трите рецептора са експресирани в листата, страничните коренови зачатъци, кореновите върхове (с изключение на кореновата капачка на GID1b) и съдовата система (фиг. 3a-c). В съцветието SAM открихме GUS сигнали само за GID1b и 1c (допълнителна фиг. 7a-c). In situ хибридизацията потвърди тези модели на експресия и допълнително демонстрира, че GID1c е равномерно експресиран на ниски нива в SAM, докато GID1b показва по-висока експресия в периферията на SAM (допълнителна фиг. 7d-l). Транслационното сливане pGID1b::2xmTQ2-GID1b също разкри градуиран диапазон на експресия на GID1b, от ниска или никаква експресия в центъра на SAM до висока експресия по границите на органите (Допълнителна фигура 7m). По този начин, GID1 рецепторите не са равномерно разпределени в и в тъканите. В последващи експерименти наблюдавахме също, че свръхекспресията на GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) повишава чувствителността на qmRGA в хипокотилите към външно приложение на GA (фиг. 3d, e). За разлика от това, флуоресценцията, измерена чрез qd17mRGA в хипокотила, е нечувствителна към третиране с GA3 (фиг. 3f, g). И за двата анализа, разсадът е третиран с високи концентрации на GA (100 μM GA3), за да се оцени бързото поведение на сензора, където способността за свързване с GID1 рецептора е засилена или загубена. Заедно тези резултати потвърждават, че биосензорът qmRGA изпълнява комбинирана функция като GA и GA сензор и предполагат, че диференциалната експресия на GID1 рецептора може значително да модулира емисионната способност на сензора.
Към днешна дата разпределението на GA сигналите в SAM остава неясно. Следователно, използвахме qmRGA-експресиращи растения и pCLV3::mCherry-NLS репортер на стволови клетки35, за да изчислим количествени карти с висока резолюция на GA сигналната активност, фокусирайки се върху L1 слоя (епидермис; Фиг. 4a, b, вижте Методи и допълнителни методи), тъй като L1 играе ключова роля в контролирането на растежа на SAM36. Тук експресията на pCLV3::mCherry-NLS осигури фиксирана геометрична референтна точка за анализ на пространствено-времевото разпределение на GA сигналната активност37. Въпреки че GA се счита за съществена за развитието на страничните органи4, наблюдавахме, че GA сигналите са ниски във флоралния примордиум (P), започвайки от етап P3 (Фиг. 4a, b), докато младите P1 и P2 примордиуми имат умерена активност, подобна на тази в централната област (Фиг. 4a, b). По-висока GA сигнална активност беше открита на границите на органните примордии, започвайки от P1/P2 (отстрани на границата) и достигайки връх при P4, както и във всички клетки на периферната област, разположена между примордиите (фиг. 4a, b и допълнителна фиг. 8a, b). Тази по-висока GA сигнална активност беше наблюдавана не само в епидермиса, но и в L2 и горните L3 слоеве (допълнителна фиг. 8b). Моделът на GA сигналите, открити в SAM с помощта на qmRGA, също остана непроменен с течение на времето (допълнителна фиг. 8c–f, k). Въпреки че конструкцията qd17mRGA беше систематично понижена в SAM на T3 растения от пет независими линии, които характеризирахме подробно, успяхме да анализираме флуоресцентните модели, получени с конструкцията pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (допълнителна фиг. 8g–j, l). В тази контролна линия бяха открити само незначителни промени в съотношението на флуоресценция в SAM, но в центъра на SAM наблюдавахме ясно и неочаквано намаление на VENUS, свързано с TagBFP. Това потвърждава, че наблюдаваният от qmRGA сигнален модел отразява GA-зависима деградация на mRGA-VENUS, но също така показва, че qmRGA може да надценява GA сигналната активност в центъра на меристема. В обобщение, нашите резултати разкриват GA сигнален модел, който отразява предимно разпределението на примордиите. Това разпределение на интерпримордиалната област (IPR) се дължи на постепенното установяване на висока GA сигнална активност между развиващия се примордиум и централната област, докато в същото време GA сигналната активност в примордиума намалява (фиг. 4в, г).
Разпределението на GID1b и GID1c рецепторите (виж по-горе) предполага, че диференциалната експресия на GA рецепторите помага за оформянето на модела на GA сигнализираща активност в SAM. Чудехме се дали може да е замесено диференциалното натрупване на GA. За да изследваме тази възможност, използвахме nlsGPS1 GA FRET сензора21. Повишена честота на активиране беше открита в SAM на nlsGPS1, третиран с 10 μM GA4+7 за 100 минути (Допълнителна фигура 9a-e), което показва, че nlsGPS1 реагира на промени в концентрацията на GA в SAM, както прави и в корените21. Пространственото разпределение на честотата на активиране на nlsGPS1 разкри относително ниски нива на GA във външните слоеве на SAM, но показа, че те са повишени в центъра и по границите на SAM (Фиг. 4e и Допълнителна фигура 9a,c). Това предполага, че GA също е разпределена в SAM с пространствен модел, сравним с този, разкрит от qmRGA. Като допълнителен подход, ние също третирахме SAM с флуоресцентен GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или самостоятелно Fl като отрицателна контрола. Fl сигналът беше разпределен в целия SAM, включително централната област и примордиума, макар и с по-ниска интензивност (фиг. 4j и допълнителна фигура 10d). За разлика от това, и трите GA-Fl се натрупаха специфично в границите на примордиума и в различна степен в останалата част от IPR, като GA7-Fl се натрупа в най-големия домейн в IPR (фиг. 4k и допълнителна фигура 10a,b). Количественото определяне на интензитета на флуоресценцията показа, че съотношението на интензитета на IPR към не-IPR е по-високо в SAM, третиран с GA-Fl, в сравнение с третирания с Fl SAM (фиг. 4l и допълнителна фигура 10c). Заедно тези резултати показват, че GA присъства в по-високи концентрации в IPR клетки, които са разположени най-близо до границата на органа. Това предполага, че моделът на SAM GA сигналната активност е резултат както от диференциалната експресия на GA рецепторите, така и от диференциалното натрупване на GA в IPR клетки близо до границите на органите. По този начин, нашият анализ разкри неочакван пространствено-времеви модел на GA сигнализация, с по-ниска активност в центъра и примордиума на SAM и по-висока активност в IPR в периферната област.
За да разберем ролята на диференциалната GA сигнална активност в SAM, анализирахме корелацията между GA сигналната активност, клетъчното разширение и клетъчното делене, използвайки изображения в реално време с ускорен кадър на SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Като се има предвид ролята на GA в регулацията на растежа, се очакваше положителна корелация с параметрите на клетъчното разширение. Следователно, първо сравнихме картите на GA сигналната активност с карти на скоростта на растеж на клетъчната повърхност (като заместител на силата на клетъчното разширение за дадена клетка и за дъщерни клетки при делене) и с карти на анизотропията на растежа, която измерва насочеността на клетъчното разширение (използвана също тук за дадена клетка и за дъщерни клетки при делене; Фиг. 5a,b, вижте Методи и допълнителни методи). Нашите карти на скоростта на растеж на клетъчната повърхност на SAM са в съответствие с предишни наблюдения38,39, с минимални скорости на растеж на границата и максимални скорости на растеж в развиващите се цветове (Фиг. 5a). Анализът на главните компоненти (PCA) показа, че GA сигналната активност е отрицателно корелирана с интензитета на растеж на клетъчната повърхност (Фигура 5c). Показахме също, че основните оси на вариация, включително входната GA сигнализация и интензитета на растежа, са ортогонални на посоката, определена от високата CLV3 експресия, което потвърждава изключването на клетките от SAM центъра в останалите анализи. Корелационният анализ на Spearman потвърди резултатите от PCA (Фигура 5d), което показва, че по-високите GA сигнали в IPR не водят до по-голямо клетъчно разширение. Корелационният анализ обаче разкри лека положителна корелация между активността на GA сигнализацията и анизотропията на растежа (Фигура 5c, d), което предполага, че по-високата GA сигнализация в IPR влияе върху посоката на клетъчния растеж и евентуално върху позицията на равнината на клетъчното делене.
a, b Топлинни карти на средния повърхностен растеж (a) и анизотропията на растежа (b) в SAM, осреднени за седем независими растения (използвани съответно като показатели за силата и посоката на клетъчното разширяване). c PCA анализът включва следните променливи: GA сигнал, интензитет на повърхностния растеж, анизотропия на повърхностния растеж и експресия на CLV3. PCA компонент 1 е основно отрицателно корелиран с интензитета на повърхностния растеж и положително корелиран с GA сигнала. PCA компонент 2 е основно положително корелиран с анизотропията на повърхностния растеж и отрицателно корелиран с експресията на CLV3. Процентите представляват вариацията, обяснена от всеки компонент. d Корелационен анализ на Spearman между GA сигнала, интензитета на повърхностния растеж и анизотропията на повърхностния растеж в тъканния мащаб, с изключение на CZ. Числото вдясно е rho стойността на Spearman между две променливи. Звездичките показват случаи, в които корелацията/отрицателната корелация е силно значима. e 3D визуализация на Col-0 SAM L1 клетки чрез конфокална микроскопия. Новите клетъчни стени, образувани в SAM (но не и в примордиума) на 10 часа, са оцветени според техните ъглови стойности. Цветната лента е показана в долния десен ъгъл. Вложката показва съответното 3D изображение в 0 h. Експериментът е повторен два пъти с подобни резултати. f Диаграмите в кутия показват скоростите на клетъчно делене в IPR и не-IPR Col-0 SAM (n = 10 независими растения). Централната линия показва медианата, а границите на кутията показват 25-ия и 75-ия персентил. Мустаците показват минималните и максималните стойности, определени с R софтуер. P стойностите са получени с двустранния t-тест на Уелч. g, h Схематична диаграма, показваща (g) как да се измери ъгълът на новата клетъчна стена (магента) спрямо радиалната посока от центъра на SAM (бяла пунктирана линия) (разглеждат се само стойности на острите ъгли, т.е. 0–90°), и (h) периферните/страничните и радиалните посоки в меристемата. i Честотни хистограми на ориентацията на равнината на клетъчното делене в SAM (тъмносиньо), IPR (средно синьо) и не-IPR (светлосиньо), съответно. P-стойностите бяха получени чрез двустранен тест на Колмогоров-Смирнов. Експериментът беше повторен два пъти с подобни резултати. j Честотни хистограми на ориентацията на равнината на клетъчното делене на IPR около P3 (светлозелено), P4 (среднозелено) и P5 (тъмнозелено), съответно. P-стойностите бяха получени чрез двустранен тест на Колмогоров-Смирнов. Експериментът беше повторен два пъти с подобни резултати.
Следователно, следващото изследване беше корелацията между GA сигнализацията и активността на клетъчното делене, като идентифицирахме новообразувани клетъчни стени по време на анализа (фиг. 5д). Този подход ни позволи да измерим честотата и посоката на клетъчното делене. Изненадващо, открихме, че честотата на клетъчните деления в IPR и останалата част от SAM (не-IPR, фиг. 5f) е сходна, което показва, че разликите в GA сигнализацията между IPR и не-IPR клетки не влияят значително на клетъчното делене. Това, както и положителната корелация между GA сигнализацията и анизотропията на растежа, ни накараха да се замислим дали GA сигнализацията може да повлияе на ориентацията на равнината на клетъчното делене. Измерихме ориентацията на новата клетъчна стена като остър ъгъл спрямо радиалната ос, свързваща центъра на меристемата и центъра на новата клетъчна стена (фиг. 5e-i) и наблюдавахме ясна тенденция клетките да се делят под ъгли, близки до 90° спрямо радиалната ос, с най-високи честоти, наблюдавани при 70–80° (23,28%) и 80–90° (22,62%) (фиг. 5e,i), съответстващи на клетъчните деления в периферна/напречна посока (фиг. 5h). За да изследваме приноса на GA сигнализацията към това поведение на клетъчното делене, анализирахме параметрите на клетъчното делене в IPR и не-IPR поотделно (фиг. 5i). Наблюдавахме, че разпределението на ъглите на делене в IPR клетките се различава от това в не-IPR клетки или в клетки в целия SAM, като IPR клетките показват по-висок дял на странични/кръгови клетъчни деления, т.е. 70–80° и 80–90° (съответно 33,86% и 30,71%, съответстващи пропорции) (фиг. 5i). По този начин, нашите наблюдения разкриха връзка между високата GA сигнализация и ориентацията на равнината на клетъчното делене, близка до периферната посока, подобно на корелацията между GA сигналната активност и анизотропията на растежа (фиг. 5c, d). За да установим допълнително пространствената консервативност на тази връзка, измерихме ориентацията на равнината на делене в IPR клетки, обграждащи примордиума, започвайки от P3, тъй като най-високата GA сигнална активност беше открита в този регион, започвайки от P4 (фиг. 4). Ъглите на делене на IPR около P3 и P4 не показаха статистически значими разлики, въпреки че беше наблюдавана повишена честота на страничните клетъчни деления в IPR около P4 (фиг. 5j). Въпреки това, в IPR клетките около P5, разликата в ориентацията на равнината на клетъчното делене става статистически значима, с рязко увеличение на честотата на напречните клетъчни деления (фиг. 5j). Взети заедно, тези резултати показват, че GA сигнализацията може да контролира ориентацията на клетъчните деления в SAM, което е в съответствие с предишни доклади40,41, че високата GA сигнализация може да индуцира странична ориентация на клетъчните деления в IPR.
Предвижда се, че клетките в IPR няма да бъдат включени в примордиите, а по-скоро в междувъзлия2,42,43. Напречната ориентация на клетъчните деления в IPR може да доведе до типичната организация на успоредни надлъжни редове от епидермални клетки в междувъзлията. Нашите наблюдения, описани по-горе, показват, че GA сигнализацията вероятно играе роля в този процес чрез регулиране на посоката на клетъчното делене.
Загубата на функция на няколко гена на DELA води до конститутивен GA отговор и della мутанти могат да бъдат използвани за тестване на тази хипотеза44. Първо анализирахме моделите на експресия на пет гена на DELA в SAM. Транскрипционното сливане на линията GUS45 разкри, че GAI, RGA, RGL1 и RGL2 (в много по-малка степен) са експресирани в SAM (Допълнителна фигура 11a-d). In situ хибридизацията допълнително показа, че GAI mRNA се натрупва специфично в примордиите и развиващите се цветове (Допълнителна фигура 11e). RGL1 и RGL3 mRNA бяха открити в целия SAM корона и в по-старите цветове, докато RGL2 mRNA беше по-изобилна в граничната област (Допълнителна фигура 11f-h). Конфокално изобразяване на pRGL3::RGL3-GFP SAM потвърди експресията, наблюдавана чрез in situ хибридизация, и показа, че RGL3 протеинът се натрупва в централната част на SAM (Допълнителна фигура 11i). Използвайки линията pRGA::GFP-RGA, открихме също, че RGA протеинът се натрупва в SAM, но неговото количество намалява на границата, започвайки от P4 (Допълнителна Фиг. 11j). Забележително е, че моделите на експресия на RGL3 и RGA са в съответствие с по-високата GA сигнална активност в IPR, както е установено чрез qmRGA (Фиг. 4). Освен това, тези данни показват, че всички PELL-ове се експресират в SAM и че тяхната експресия колективно обхваща целия SAM.
След това анализирахме параметрите на клетъчното делене в дивия тип SAM (Ler, контрола) и gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (глобални) мутанти (фиг. 6a, b). Интересното е, че наблюдавахме статистически значима промяна в разпределението на честотите на ъглите на клетъчното делене в della global мутанта SAM в сравнение с дивия тип (фиг. 6c). Тази промяна в della global мутанта се дължи на увеличение на честотата на ъглите 80–90° (34,71% спрямо 24,55%) и, в по-малка степен, на ъглите 70–80° (23,78% спрямо 20,18%), т.е. съответстващи на напречните клетъчни деления (фиг. 6c). Честотата на ненапречните клетъчни деления (0–60°) също беше по-ниска в della global мутанта (фиг. 6c). Честотата на напречните клетъчни деления беше значително повишена в SAM на della global мутанта (фиг. 6b). Честотата на напречните клетъчни деления в IPR също беше по-висока при della global мутанта в сравнение с дивия тип (фиг. 6d). Извън IPR областта, дивият тип имаше по-равномерно разпределение на ъглите на клетъчното делене, докато della global мутантът предпочиташе тангенциални деления като IPR (фиг. 6e). Също така количествено определихме ориентацията на клетъчните деления в SAM на ga2 оксидазни (ga2ox) петкратни мутанти (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), GA-неактивен мутант, в който GA се натрупва. В съответствие с повишаването на нивата на GA, SAM на петократното ga2ox мутантно съцветие беше по-голямо от това на Col-0 (Допълнителна фигура 12a, b) и в сравнение с Col-0, петократното ga2ox SAM показа отчетливо различно разпределение на ъглите на клетъчно делене, като честотата на ъгъла се увеличава от 50° до 90°, т.е. отново в полза на тангенциалните деления (Допълнителна фигура 12a-c). По този начин, ние показваме, че конститутивното активиране на GA сигнализацията и натрупването на GA индуцират странични клетъчни деления в IPR и останалата част от SAM.
a, b 3D визуализация на L1 слоя на PI-оцветен Ler (a) и глобален dela мутант (b) SAM, използвайки конфокална микроскопия. Показани са нови клетъчни стени, образувани в SAM (но не и в примордиума) за период от 10 часа, и са оцветени според техните ъглови стойности. Вложката показва SAM при 0 часа. Цветната лента е показана в долния десен ъгъл. Стрелката в (b) сочи към пример за подравнени клетъчни файлове в глобалния dela мутант. Експериментът е повторен два пъти с подобни резултати. ce сравнение на честотното разпределение на ориентациите на равнината на клетъчното делене в целия SAM (d), IPR (e) и non-IPR (f) между Ler и глобален dela. P стойностите са получени с помощта на двустранен тест на Колмогоров-Смирнов. f, g 3D визуализация на конфокални изображения на PI-оцветен SAM на трансгенни растения Col-0 (i) и pCUC2::gai-1-VENUS (j). Панели (a, b) показват нови клетъчни стени (но не и примордии), образувани в SAM в рамките на 10 часа. Експериментът е повторен два пъти с подобни резултати. h–j Сравнение на честотното разпределение на ориентациите на равнината на клетъчното делене, разположени в целия SAM (h), IPR (i) и не-IPR (j) между растенията Col-0 и pCUC2::gai-1-VENUS. P стойностите са получени с помощта на двустранен тест на Колмогоров-Смирнов.
След това тествахме ефекта от инхибиране на GA сигнализацията специфично в IPR. За тази цел използвахме промотора на котиледонната чашка 2 (CUC2), за да стимулираме експресията на доминантен негативен gai-1 протеин, слят с VENUS (в линията pCUC2::gai-1-VENUS). В див тип SAM, промоторът CUC2 задвижва експресията на повечето IPR в SAM, включително граничните клетки, от P4 нататък, и подобна специфична експресия беше наблюдавана в растения pCUC2::gai-1-VENUS (вижте по-долу). Разпределението на ъглите на клетъчно делене в SAM или IPR на растенията pCUC2::gai-1-VENUS не се различаваше значително от това на дивия тип, въпреки че неочаквано открихме, че клетки без IPR в тези растения се делят с по-висока честота от 80–90° (фиг. 6f–j).
Предполага се, че посоката на клетъчното делене зависи от геометрията на SAM, по-специално от напрежението на опън, генерирано от изкривяването на тъканта46. Затова се запитахме дали формата на SAM е променена в растенията della global mutant и pCUC2::gai-1-VENUS. Както беше съобщено по-рано12, размерът на SAM на della global мутанта е по-голям от този на дивия тип (Допълнителна фигура 13a, b, d). In situ хибридизацията на CLV3 и STM РНК потвърди разширяването на меристема в della мутанти и допълнително показа латералното разширяване на нишата на стволовите клетки (Допълнителна фигура 13e, f, h, i). Кривината на SAM обаче беше сходна и в двата генотипа (Допълнителна фигура 13k, m, n, p). Наблюдавахме подобно увеличение на размера в gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della четворния мутант без промяна в кривината в сравнение с дивия тип (Допълнителна фигура 13c, d, g, j, l, o, p). Честотата на ориентация на клетъчното делене също е била засегната при четворния мутант della, но в по-малка степен, отколкото при монолитния мутант della (Допълнителна фигура 12d-f). Този ефект на дозата, заедно с липсата на ефект върху кривината, предполага, че остатъчната RGL3 активност в четворния мутант Della ограничава промените в ориентацията на клетъчното делене, причинени от загуба на DELLA активност, и че промените в страничните клетъчни деления настъпват в отговор на промени в GA сигналната активност, а не на промени в геометрията на SAM. Както е описано по-горе, промоторът CUC2 задвижва експресията на IPR в SAM, започвайки от P4 (Допълнителна фигура 14a, b), и за разлика от това, pCUC2::gai-1-VENUS SAM има намален размер, но по-висока кривина (Допълнителна фигура 14c-h). Тази промяна в морфологията на pCUC2::gai-1-VENUS SAM може да доведе до различно разпределение на механичните напрежения в сравнение с дивия тип, при който високите периферни напрежения започват на по-късо разстояние от центъра на SAM47. Алтернативно, промените в морфологията на pCUC2::gai-1-VENUS SAM могат да са резултат от промени в регионалните механични свойства, индуцирани от трансгенна експресия48. И в двата случая това би могло частично да компенсира ефектите от промените в GA сигнализацията чрез увеличаване на вероятността клетките да се делят в периферна/напречна ориентация, което обяснява нашите наблюдения.
Взети заедно, нашите данни потвърждават, че по-високата GA сигнализация играе активна роля в страничната ориентация на равнината на клетъчното делене в IPR. Те също така показват, че кривината на меристемата също влияе върху ориентацията на равнината на клетъчното делене в IPR.
Напречната ориентация на равнината на делене в IPR, поради високата GA сигнална активност, предполага, че GA предварително организира радиален клетъчен файл в епидермиса в рамките на SAM, за да дефинира клетъчната организация, която по-късно ще бъде открита в епидермалния интернодиум. Всъщност, такива клетъчни файлове често се виждаха в SAM изображения на della global мутанти (фиг. 6b). По този начин, за да изследваме по-нататък функцията за развитие на пространствения модел на GA сигнализацията в SAM, използвахме time-lapse изображения, за да анализираме пространствената организация на клетките в IPR в трансгенни растения от див тип (Ler и Col-0), della global мутанти и pCUC2::gai-1-VENUS.
Установихме, че qmRGA показва, че GA сигналната активност в IPR се увеличава от P1/P2 и достига пик при P4, като този модел остава постоянен с течение на времето (фиг. 4a–f и допълнителна фиг. 8c–f, k). За да анализираме пространствената организация на клетките в IPR с нарастващ GA сигнал, маркирахме Ler IPR клетки над и отстрани на P4 според тяхната съдба в развитието, анализирана 34 часа след първото наблюдение, т.е. повече от два пластидни пъти, което ни позволява да проследим IPR клетките по време на развитието на примордиума от P1/P2 до P4. Използвахме три различни цвята: жълт за клетките, които са интегрирани в примордиума близо до P4, зелен за тези, които са били в IPR, и лилав за тези, които са участвали и в двата процеса (фиг. 7a–c). При t0 (0 h), 1–2 слоя IPR клетки бяха видими пред P4 (фиг. 7a). Както се очакваше, когато тези клетки се делиха, те го правеха главно чрез напречната равнина на делене (фиг. 7a–c). Подобни резултати са получени при използване на Col-0 SAM (фокусирайки се върху P3, чиято граница се сгъва подобно на P4 при Ler), въпреки че при този генотип гънката, образувана на флоралната граница, е скрила IPR клетките по-бързо (фиг. 7g–i). По този начин, моделът на делене на IPR клетките предварително организира клетките в радиални редове, както е при междувъзлията. Организацията на радиалните редове и локализацията на IPR клетките между последователни органи предполагат, че тези клетки са междувъзлови прогенитори.
Тук разработихме ratiometric GA сигнален биосензор, qmRGA, който позволява количествено картографиране на GA сигналната активност в резултат на комбинирани концентрации на GA и GA рецептори, като същевременно минимизира интерференцията с ендогенните сигнални пътища, като по този начин предоставя информация за GA функцията на клетъчно ниво. За тази цел конструирахме модифициран PELL протеин, mRGA, който е загубил способността си да се свързва с PELL интеракционни партньори, но остава чувствителен към GA-индуцирана протеолиза. qmRGA реагира както на екзогенни, така и на ендогенни промени в нивата на GA, а динамичните му сензорни свойства позволяват оценка на пространствено-времевите промени в GA сигналната активност по време на развитието. qmRGA е също така много гъвкав инструмент, тъй като може да се адаптира към различни тъкани чрез промяна на промотора, използван за неговата експресия (ако е необходимо), и предвид консервативния характер на GA сигналния път и PFYRE мотива при покритосеменните растения, е вероятно да бъде прехвърлен към други видове22. В съответствие с това, еквивалентна мутация в оризовия SLR1 PE протеин (HYY497AAA) също е доказано, че потиска репресорната активност на растежа на SLR1, като същевременно само леко намалява неговото GA-медиирано разграждане, подобно на mRGA23. Забележително е, че скорошни проучвания при Arabidopsis показват, че мутация на единична аминокиселина в PFYRE домейна (S474L) променя транскрипционната активност на RGA, без да повлиява способността му да взаимодейства с партньори на транскрипционни фактори50. Въпреки че тази мутация е много близка до 3-те аминокиселинни замествания, присъстващи в mRGA, нашите проучвания показват, че тези две мутации променят различни характеристики на PE. Въпреки че повечето партньори на транскрипционни фактори се свързват с LHR1 и SAW домейните на PE26,51, някои запазени аминокиселини в PFYRE домейна могат да помогнат за стабилизиране на тези взаимодействия.
Развитието на междувъзлията е ключова характеристика в растителната архитектура и подобряването на добива. qmRGA разкри по-висока GA сигнална активност в IPR междувъзални прогениторни клетки. Чрез комбиниране на количествено изобразяване и генетика, ние показахме, че GA сигналните модели наслагват кръгови/напречни равнини на клетъчно делене в епидермиса на SAM, оформяйки организацията на клетъчното делене, необходима за развитието на междувъзлията. Няколко регулатора на ориентацията на равнината на клетъчното делене са идентифицирани по време на развитието52,53. Нашата работа предоставя ясен пример за това как GA сигналната активност регулира този клетъчен параметър.PE може да взаимодейства с протеинови комплекси преди сгъване41, така че GA сигнализацията може да регулира ориентацията на равнината на клетъчното делене, като директно влияе върху ориентацията на кортикалните микротубули40,41,54,55. Неочаквано показахме, че в SAM корелатът на по-високата GA сигнална активност не е клетъчното удължаване или делене, а само анизотропия на растежа, което е в съответствие с директния ефект на GA върху посоката на клетъчното делене в IPR. Не можем обаче да изключим, че този ефект може да бъде и косвен, например медииран от GA-индуцирано омекване на клетъчната стена56. Промените в свойствата на клетъчната стена предизвикват механично напрежение57,58, което може също да повлияе на ориентацията на равнината на клетъчното делене, като повлияе на ориентацията на кортикалните микротубули39,46,59. Комбинираните ефекти на индуцираното от GA механично напрежение и директното регулиране на ориентацията на микротубулите от GA може да са включени в генерирането на специфичен модел на ориентация на клетъчното делене в IPR, за да се дефинират междувъзлия, и са необходими допълнителни изследвания, за да се тества тази идея. По подобен начин, предишни изследвания подчертават значението на взаимодействащите с DNA протеини TCP14 и 15 в контрола на образуването на междувъзлия60,61 и тези фактори могат да медиират действието на GA заедно с BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), които регулират развитието на междувъзлията и е доказано, че влияят на GA сигнализацията2,62. Като се има предвид, че ДЕЛ взаимодействат със сигналните пътища на брасиностероидите, етилена, жасмоновата киселина и абсцизовата киселина (ABA)63,64 и че тези хормони могат да повлияят на ориентацията на микротубулите65, ефектите на GA върху ориентацията на клетъчното делене могат да бъдат медиирани и от други хормони.
Ранни цитологични проучвания показват, че както вътрешните, така и външните области на Arabidopsis SAM са необходими за развитието на междувъзлията2,42. Фактът, че GA активно регулира клетъчното делене във вътрешните тъкани12, подкрепя двойната функция на GA в регулирането на размера на меристемата и междувъзлията в SAM. Моделът на насочено клетъчно делене също е строго регулиран във вътрешната тъкан на SAM и тази регулация е от съществено значение за растежа на стъблото52. Ще бъде интересно да се проучи дали GA играе роля и в ориентирането на равнината на клетъчното делене във вътрешната организация на SAM, като по този начин синхронизира спецификацията и развитието на междувъзлията в SAM.
Растенията са отглеждани in vitro в почва или 1x Murashige-Skoog (MS) среда (Duchefa), допълнена с 1% захароза и 1% агар (Sigma) при стандартни условия (16 часа светлина, 22 °C), с изключение на експериментите с хипокотил и растеж на корени, при които разсадът е отглеждан върху вертикални плаки при постоянна светлина и 22 °C. За експериментите с нитрати, растенията са отглеждани в модифицирана MS среда (bioWORLD plant medium), допълнена с адекватно количество нитрати (0 или 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-сукцинат, 1% захароза и 1% A-агар (Sigma) при условия на дълъг ден.
кДНК на GID1a, вмъкната в pDONR221, беше рекомбинирана с pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry в pB7m34GW, за да се генерира pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК на IDD2, вмъкната в pDONR221, беше рекомбинирана в pB7RWG266, за да се генерира p35S:IDD2-RFP. За да се генерира pGID1b::2xmTQ2-GID1b, 3.9 kb фрагмент нагоре по веригата от кодиращия регион на GID1b и 4.7 kb фрагмент, съдържащ GID1b кДНК (1.3 kb) и терминатор (3.4 kb), първо бяха амплифицирани с помощта на праймерите в Допълнителна Таблица 3, след което бяха вмъкнати съответно в pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), и накрая рекомбинирани с pDONR221 2xmTQ268 в целевия вектор pGreen 012567, използвайки Gateway клониране. За да се генерира pCUC2::LSSmOrange, промоторната последователност CUC2 (3229 bp нагоре по течението на ATG), последвана от кодиращата последователност на големия Stokes-изместен mOrange (LSSmOrange)69 с N7 сигнала за ядрена локализация и NOS транскрипционния терминатор, бяха сглобени в pGreen канамицин-таргетния вектор, използвайки Gateway 3-фрагментната рекомбинационна система (Invitrogen). Растителният бинарен вектор беше въведен съответно в щам Agrobacterium tumefaciens GV3101 и в листата на Nicotiana benthamiana чрез метод на инфилтрация на Agrobacterium и в Arabidopsis thaliana Col-0 чрез метод на флорално потапяне. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA бяха изолирани съответно от F3 и F1 потомството на съответните кръстоски.
РНК in situ хибридизацията беше извършена върху върхове на издънки с дължина приблизително 1 cm72, които бяха събрани и незабавно фиксирани в разтвор на FAA (3,7% формалдехид, 5% оцетна киселина, 50% етанол), предварително охладен до 4 °C. След 2 × 15 min вакуумни обработки, фиксаторът беше сменен и пробите бяха инкубирани за една нощ. кДНК на GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3 и антисенс сонди към техните 3'-UTR бяха синтезирани, използвайки праймерите, показани в Допълнителна таблица 3, както е описано от Rosier et al.73. Дигоксигенин-маркирани сонди бяха имунодетектирани с помощта на дигоксигенинови антитела (3000-кратно разреждане; Roche, каталожен номер: 11 093 274 910), а срезите бяха оцветени с разтвор на 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP, 250-кратно разреждане)/нитросин тетразолий (NBT, 200-кратно разреждане).
Време на публикуване: 10 февруари 2025 г.