В това проучване, стимулиращите ефекти на комбинираното лечение нарегулатори на растежа на растениятаИзследвани са (2,4-D и кинетин) и наночастици от железен оксид (Fe₃O₄-NPs) върху in vitro морфогенезата и производството на вторични метаболити в *Hypericum perforatum* L. Оптимизираното третиране [2,4-D (0.5 mg/L) + кинетин (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] значително подобри параметрите на растеж на растенията: височината на растението се увеличи с 59.6%, дължината на корена със 114.0%, броят на пъпките със 180.0% и теглото на калуса в прясно състояние със 198.3% в сравнение с контролната група. Това комбинирано третиране също така подобри ефективността на регенерация (50.85%) и увеличи съдържанието на хиперицин с 66.6%. GC-MS анализът разкри високо съдържание на хиперозид, β-патолен и цетилов алкохол, което представлява 93,36% от общата площ на пика, докато съдържанието на общи феноли и флавоноиди се е увеличило с до 80,1%. Тези резултати показват, че регулаторите на растежа на растенията (PGRs) и Fe₃O₄ наночастиците (Fe₃O₄-NPs) упражняват синергичен ефект чрез стимулиране на органогенезата и натрупването на биоактивни съединения, което представлява обещаваща стратегия за биотехнологично усъвършенстване на лечебните растения.
Жълтият кантарион (Hypericum perforatum L.), известен още като жълт кантарион, е многогодишно тревисто растение от семейство Hypericaceae, което има икономическа стойност.[1] Неговите потенциални биоактивни компоненти включват естествени танини, ксантони, флороглуцинол, нафталендиантрон (хиперин и псевдохиперин), флавоноиди, фенолни киселини и етерични масла.[2,3,4] Жълтият кантарион може да се размножава по традиционни методи; сезонността на традиционните методи, ниската кълняемост на семената и податливостта към болести обаче ограничават потенциала му за мащабно култивиране и непрекъснато образуване на вторични метаболити.[1,5,6]
Следователно, in vitro тъканната култура се счита за ефективен метод за бързо размножаване на растенията, запазване на ресурсите от зародишна плазма и повишен добив на лекарствени съединения [7, 8]. Регулаторите на растежа на растенията (PGR) играят ключова роля в регулирането на морфогенезата и са необходими за in vitro култивирането на калус и цели организми. Оптимизирането на техните концентрации и комбинации е от решаващо значение за успешното завършване на тези процеси на развитие [9]. Следователно, разбирането на подходящия състав и концентрация на регулаторите е важно за подобряване на растежа и регенеративния капацитет на жълтия кантарион (H. perforatum) [10].
Наночастиците от железен оксид (Fe₃O₄) са клас наночастици, които са били или се разработват за тъканни култури. Fe₃O₄ има значителни магнитни свойства, добра биосъвместимост и способност да стимулира растежа на растенията и да намалява стреса от околната среда, така че е привлякъл значително внимание в дизайна на тъканни култури. Потенциалните приложения на тези наночастици могат да включват оптимизиране на in vitro културата за насърчаване на клетъчното делене, подобряване на усвояването на хранителни вещества и активиране на антиоксидантни ензими [11].
Въпреки че наночастиците са показали добри стимулиращи ефекти върху растежа на растенията, проучванията върху комбинираното приложение на Fe₃O₄ наночастици и оптимизирани регулатори на растежа на растенията в *H. perforatum* остават оскъдни. За да се запълни тази празнина в знанията, това проучване оценява ефектите от комбинираните им ефекти върху in vitro морфогенезата и производството на вторични метаболити, за да предостави нови прозрения за подобряване на характеристиките на лечебните растения. Следователно, това проучване има две цели: (1) оптимизиране на концентрацията на регулатори на растежа на растенията, за да се насърчи ефективно образуването на калус, регенерацията на леторастите и вкореняването in vitro; и (2) оценка на ефектите на Fe₃O₄ наночастиците върху параметрите на растеж in vitro. Бъдещите планове включват оценка на процента на оцеляване на регенерираните растения по време на аклиматизация (in vitro). Очаква се резултатите от това проучване значително да подобрят ефективността на микроразмножаването на *H. perforatum*, като по този начин допринесат за устойчивото използване и биотехнологичните приложения на това важно лечебно растение.
В това проучване получихме листни експланти от отглеждани на полето едногодишни растения жълт кантарион (майчини растения). Тези експланти бяха използвани за оптимизиране на условията за култивиране in vitro. Преди култивиране листата бяха обилно изплакнати под течаща дестилирана вода в продължение на няколко минути. Повърхностите на експлантите бяха дезинфекцирани чрез потапяне в 70% етанол за 30 секунди, последвано от потапяне в 1,5% разтвор на натриев хипохлорит (NaOCl), съдържащ няколко капки Tween 20 за 10 минути. Накрая експлантите бяха изплакнати три пъти със стерилна дестилирана вода, преди да бъдат прехвърлени в следващата хранителна среда.
През следващите четири седмици бяха измерени параметрите на регенерация на леторастите, включително скоростта на регенерация, броя на леторастите на експлант и дължината на леторастите. Когато регенерираните леторасти достигнаха дължина от поне 2 см, те бяха прехвърлени в среда за вкореняване, състояща се от половин концентрирана MS среда, 0,5 mg/L индолбутирова киселина (IBA) и 0,3% гуарова гума. Култивирането на вкореняване продължи три седмици, през което време бяха измерени скоростта на вкореняване, броят на корените и дължината на корените. Всяко третиране беше повторено три пъти, като на повторение бяха култивирани по 10 експланта, което доведе до приблизително 30 експланта на третиране.
Височината на растенията беше измерена в сантиметри (см) с помощта на линийка, от основата на растението до върха на най-високия лист. Дължината на корена беше измерена в милиметри (мм) веднага след внимателното отстраняване на разсада и отстраняване на растежната среда. Броят на пъпките на експлант беше преброен директно върху всяко растение. Броят на черните петна по листата, известни като нодули, беше измерен визуално. Смята се, че тези черни нодули са жлези, съдържащи хиперицин, или оксидативни петна, и се използват като физиологичен индикатор за реакцията на растението на третирането. След отстраняване на цялата растежна среда, прясното тегло на разсада беше измерено с помощта на електронна везна с точност до милиграми (мг).
Методът за изчисляване на скоростта на образуване на калус е следният: след култивиране на експланти в среда, съдържаща различни растежни регулатори (кинази, 2,4-D и Fe3O4) в продължение на четири седмици, се преброява броят на експлантите, способни да образуват калус. Формулата за изчисляване на скоростта на образуване на калус е следната:
Всяко третиране се повтаря три пъти, като при всяко повторение се изследват поне 10 експланта.
Скоростта на регенерация отразява дела на калусната тъкан, която успешно завършва процеса на диференциация на пъпките след етапа на образуване на калус. Този показател демонстрира способността на калусната тъкан да се трансформира в диференцирана тъкан и да се развива в нови растителни органи.
Коефициентът на вкореняване е съотношението на броя на клоните, способни да се вкоренят, към общия брой клони. Този показател отразява успеха на етапа на вкореняване, който е от решаващо значение при микроразмножаването и размножаването на растенията, тъй като доброто вкореняване помага на разсада да оцелее по-добре в условията на отглеждане.
Хиперициновите съединения бяха екстрахирани с 90% метанол. Петдесет мг изсушен растителен материал беше добавен към 1 мл метанол и обработен с ултразвук в продължение на 20 минути при 30 kHz в ултразвуков почистващ препарат (модел A5120-3YJ) при стайна температура на тъмно. След обработка с ултразвук, пробата беше центрофугирана при 6000 rpm за 15 минути. Супернатантът беше събран и абсорбцията на хиперицин беше измерена при 592 nm, използвайки спектрофотометър Plus-3000 S, съгласно метода, описан от Conceiçao et al. [14].
Повечето третирания с регулатори на растежа на растенията (PGRs) и наночастици от железен оксид (Fe₃O₄-NPs) не индуцираха образуване на черни нодули върху регенерирани листа от леторасти. Не бяха наблюдавани нодули при нито едно от третиранията с 0,5 или 1 mg/L 2,4-D, 0,5 или 1 mg/L кинетин или 1, 2 или 4 mg/L наночастици от железен оксид. Няколко комбинации показаха леко увеличение на развитието на нодули (но не статистически значимо) при по-високи концентрации на кинетин и/или наночастици от железен оксид, като например комбинацията от 2,4-D (0,5–2 mg/L) с кинетин (1–1,5 mg/L) и наночастици от железен оксид (2–4 mg/L). Тези резултати са показани на Фигура 2. Черните нодули представляват богати на хиперицин жлези, както естествено срещащи се, така и полезни. В това проучване черните нодули са свързани главно с покафеняване на тъканите, което показва благоприятна среда за натрупване на хиперицин. Третирането с 2,4-D, кинетин и Fe₃O₄ наночастици стимулира растежа на калуса, намалява покафеняването и увеличава съдържанието на хлорофил, което предполага подобрена метаболитна функция и потенциално намаляване на оксидативното увреждане [37]. Това проучване оценява ефектите на кинетина в комбинация с 2,4-D и Fe₃O₄ наночастици върху растежа и развитието на калуса от жълт кантарион (фиг. 3a–g). Предишни проучвания показват, че Fe₃O₄ наночастиците имат противогъбична и антимикробна активност [38, 39] и, когато се използват в комбинация с регулатори на растежа на растенията, могат да стимулират защитните механизми на растенията и да намалят индексите на клетъчен стрес [18]. Въпреки че биосинтезът на вторични метаболити е генетично регулиран, действителният им добив е силно зависим от условията на околната среда. Метаболитните и морфологичните промени могат да повлияят на нивата на вторичните метаболити чрез регулиране на експресията на специфични растителни гени и реагиране на фактори на околната среда. Освен това, индукторите могат да задействат активирането на нови гени, които от своя страна стимулират ензимната активност, като в крайна сметка активират множество биосинтетични пътища и водят до образуване на вторични метаболити. Освен това, друго проучване показа, че намаляването на засенчването увеличава излагането на слънчева светлина, като по този начин повишава дневните температури в естественото местообитание на *Hypericum perforatum*, което също допринася за повишен добив на хиперицин. Въз основа на тези данни, това проучване изследва ролята на железните наночастици като потенциални индуктори в тъканните култури. Резултатите показват, че тези наночастици могат да активират гени, участващи в биосинтеза на хесперидин, чрез ензимна стимулация, което води до повишено натрупване на това съединение (фиг. 2). Следователно, в сравнение с растенията, растящи в естествени условия, може да се твърди, че производството на такива съединения in vivo също може да се подобри, когато умереният стрес се комбинира с активирането на гени, участващи в биосинтеза на вторични метаболити. Комбинираните лечения обикновено имат положителен ефект върху скоростта на регенерация, но в някои случаи този ефект е отслабен. По-специално, третирането с 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L киназа и различни концентрации може независимо и значително да увеличи скоростта на регенерация с 50,85% в сравнение с контролната група (фиг. 4в). Тези резултати показват, че специфични комбинации от нанохормони могат да действат синергично, за да стимулират растежа на растенията и производството на метаболити, което е от голямо значение за тъканните култури на лечебните растения. Палмър и Келер [50] показаха, че третирането с 2,4-D може независимо да индуцира образуването на калус в St. perforatum, докато добавянето на киназа значително подобрява образуването и регенерацията на калус. Този ефект се дължи на подобряването на хормоналния баланс и стимулирането на клетъчното делене. Бал и др. [51] установиха, че третирането с Fe₃O₄-NP може независимо да подобри функцията на антиоксидантните ензими, като по този начин стимулира растежа на корените в St. perforatum. Културални среди, съдържащи Fe₃O₄ наночастици в концентрации от 0,5 mg/L, 1 mg/L и 1,5 mg/L, подобряват скоростта на регенерация на ленените растения [52]. Използването на кинетин, 2,4-дихлоробензотиазолинон и Fe₃O₄ наночастици значително подобрява скоростта на образуване на калус и корени, но е необходимо да се вземат предвид потенциалните странични ефекти от използването на тези хормони за in vitro регенерация. Например, дългосрочната или висококонцентрирана употреба на 2,4-дихлоробензотиазолинон или кинетин може да доведе до соматични клонови вариации, оксидативен стрес, анормална морфология на калуса или витрификация. Следователно, високата скорост на регенерация не е задължително да предсказва генетична стабилност. Всички регенерирани растения трябва да бъдат оценени с помощта на молекулярни маркери (напр. RAPD, ISSR, AFLP) или цитогенетичен анализ, за да се определи тяхната хомогенност и сходство с in vivo растенията [53,54,55].
Това проучване за първи път демонстрира, че комбинираната употреба на регулатори на растежа на растенията (2,4-D и кинетин) с Fe₃O₄ наночастици може да подобри морфогенезата и натрупването на ключови биоактивни метаболити (включително хиперицин и хиперозид) в *Hypericum perforatum*. Оптимизираният режим на третиране (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L кинетин + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) не само максимизира образуването на калус, органогенезата и добива на вторични метаболити, но също така демонстрира лек индуциращ ефект, потенциално подобрявайки стресоустойчивостта на растението и медицинската му стойност. Комбинацията от нанотехнологии и растителна тъканна култура осигурява устойчива и ефикасна платформа за мащабно in vitro производство на лекарствени съединения. Тези резултати проправят пътя за индустриални приложения и бъдещи изследвания на молекулярните механизми, оптимизацията на дозировката и генетичната прецизност, като по този начин свързват фундаменталните изследвания на лечебните растения с практическата биотехнология.
Време на публикуване: 12 декември 2025 г.