Антихелминтното лекарство N,N-диетил-m-толуамид (ДЕЕТ) е съобщено, че инхибира AChE (ацетилхолинестеразата) и има потенциални канцерогенни свойства поради прекомерна васкуларизация. В тази статия показваме, че DEET специфично стимулира ендотелните клетки, които насърчават ангиогенезата, като по този начин увеличават растежа на тумора. DEET активира клетъчните процеси, водещи до ангиогенеза, включително пролиферация, миграция и адхезия. Това е свързано с повишено производство на NO и експресия на VEGF в ендотелните клетки. Заглушаването на M3 или използването на фармакологични M3 инхибитори премахва всички тези ефекти, което предполага, че индуцираната от DEET ангиогенеза е M3-чувствителна. Експерименти, включващи калциева сигнализация в ендотелни и HEK клетки, свръхекспресиращи M3 рецептори, както и проучвания за свързване и докинг, показват, че DEET действа като алостеричен модулатор на M3 рецепторите. Освен това, DEET инхибира AChE, като по този начин увеличава бионаличността на ацетилхолина и неговото свързване с M3 рецепторите и засилва проангиогенните ефекти чрез алостерична регулация.
Първичните ендотелни клетки (ECs) бяха изолирани от аортата на швейцарски мишки. Методът на екстракция беше адаптиран от протокола на Кобаяши26. Мишите ECs бяха култивирани в EBM-2 среда, допълнена с 5% инактивиран чрез топлина FBS до четвъртия пасаж.
Ефектът на две концентрации на DEET върху пролиферацията на HUVEC, U87MG или BF16F10 беше анализиран с помощта на CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Накратко, 5.103 клетки на ямка бяха посяти в 96-ямкова плака, оставени да се прикрепят за една нощ и след това третирани с DEET за 24 часа. След отстраняване на растежната среда, добавете разтвор за свързване с багрилото към всяка ямка на микроплаката и инкубирайте клетките при 37°C за 30 минути. Нивата на флуоресценция бяха определени с помощта на Mithras LB940 многомодов четец за микроплаки (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия), оборудван с 485 nm възбуждащи филтри и 530 nm емисионни филтри.
HUVEC бяха посяти в 96-ямкови плаки при плътност от 104 клетки на ямка. Клетките бяха третирани с DEET в продължение на 24 часа. Клетъчната жизнеспособност беше оценена с помощта на колориметричен MTT анализ (Sigma-Aldrich, M5655). Стойностите на оптичната плътност бяха получени на многомодов микроплаков четец (Mithras LB940) при дължина на вълната 570 nm.
Ефектите на DEET бяха изследвани с помощта на in vitro ангиогенетични тестове. Третирането с 10-8 M или 10-5 M DEET увеличи образуването на капилярна дължина в HUVEC (Фиг. 1a, b, бели ленти). В сравнение с контролната група, третирането с DEET концентрации от 10-14 до 10-5 M показа, че капилярната дължина достигна плато при 10-8 M DEET (Допълнителна Фиг. S2). Не беше установена значителна разлика в in vitro проангиогенния ефект на HUVEC, третирани с DEET в концентрационния диапазон от 10-8 M и 10-5 M.
За да определим ефекта на DEET върху неоваскуларизацията, проведохме in vivo изследвания за неоваскуларизация. След 14 дни, мишки, инжектирани с ендотелни клетки, предварително култивирани с 10-8 M или 10-5 M DEET, показаха значително повишаване на съдържанието на хемоглобин (фиг. 1в, бели ленти).
Освен това, индуцираната от DEET неоваскуларизация е изследвана при мишки с ксенотрансплантат U87MG, на които е инжектиран ежедневно (ip) DEET в доза, за която е известно, че индуцира плазмени концентрации от 10-5 M, което е нормално при експонирани хора. в 23. Откриваеми тумори (т.е. тумори >100 mm3) са наблюдавани 14 дни след инжектирането на U87MG клетки в мишки. На 28-ия ден растежът на тумора е значително засилен при третираните с DEET мишки в сравнение с контролните мишки (фиг. 1d, квадрати). Освен това, оцветяването на тумори с CD31 показва, че DEET значително увеличава капилярната площ, но не и плътността на микросъдовете. (фиг. 1e-g).
За да се определи ролята на мускариновите рецептори в DETA-индуцираната пролиферация, е използван 10-8 M или 10-5 M DETA в присъствието на pFHHSiD (10-7 M, селективен антагонист на M3 рецептора). Третирането на HUVEC с pFHHSiD напълно блокира пролиферативните свойства на DETA при всички концентрации (Таблица 1).
При тези условия, ние също така изследвахме дали DEET би увеличил дължината на капилярите в HUVEC клетки. По подобен начин, pFHHSiD значително предотвратява индуцираната от DEET дължина на капилярите (фиг. 1a, b, сиви ленти). Освен това, подобни експерименти бяха проведени с M3 siRNA. Въпреки че контролната siRNA не беше ефективна в насърчаването на образуването на капиляри, заглушаването на M3 мускариновия рецептор премахна способността на DEET да увеличава дължината на капилярите (фиг. 1a, b, черни ленти).
Освен това, както 10-8 M, така и 10-5 M DEET-индуцираната васкуларизация in vitro, така и неоваскуларизацията in vivo бяха напълно блокирани от pFHHSiD (фиг. 1c, d, кръгове). Тези резултати показват, че DEET насърчава ангиогенезата чрез път, чувствителен към селективни M3 рецепторни антагонисти или M3 siRNA.
AChE е молекулярната мишена на DEET. Лекарства като донепезил, които действат като AChE инхибитори, могат да стимулират ендотелната ангиогенеза in vitro и в модели на исхемия на задните крайници при мишки14. Тествахме ефекта на две концентрации на DEET върху активността на AChE ензима в HUVEC. Ниските (10-8 M) и високите (10-5 M) концентрации на DEET намалиха ендотелната AChE активност в сравнение с контролните условия (фиг. 2).
И двете концентрации на DEET (10-8 M и 10-5 M) намалиха ацетилхолинестеразната активност върху HUVEC. BW284c51 (10-5 M) беше използван като контрола за ацетилхолинестеразни инхибитори. Резултатите са изразени като процент от AChE активността върху HUVEC, третирани с двете концентрации на DEET, в сравнение с клетки, третирани с плацебо. Стойностите са изразени като средна стойност ± SEM от шест независими експеримента. *p < 0,05 в сравнение с контролата (тест за множествено сравнение на Kruskal-Wallis и Dunn).
Азотният оксид (NO) участва в ангиогенния процес 33, следователно е изследвано производството на NO в стимулирани с DEET HUVEC клетки. Ендотелното производство на NO, третирано с DEET, е повишено в сравнение с контролните клетки, но достига значимост само при доза от 10-8 M (фиг. 3в). За да се определят молекулярните промени, контролиращи индуцираното от DEET производство на NO, експресията и активирането на eNOS са анализирани чрез Western blotting. Въпреки че третирането с DEET не променя експресията на eNOS, то значително увеличава фосфорилирането на eNOS в активиращия му сайт (Ser-1177), като същевременно намалява инхибиторния му сайт (Thr-495) в сравнение с нетретираните клетки при фосфорилиране на eNOS (фиг. 3d). Освен това, съотношението на фосфорилирания eNOS в активиращия и инхибиторния сайт е изчислено след нормализиране на количеството фосфорилиран eNOS към общото количество ензим. Това съотношение е значително повишено в HUVEC клетки, третирани с всяка концентрация на DEET, в сравнение с нетретираните клетки (фиг. 3d).
Накрая, експресията на VEGF, един от основните проангиогенни фактори, беше анализирана чрез Western blotting. DEET значително увеличи експресията на VEGF, докато pFHHSiD напълно блокира тази експресия.
Тъй като ефектите на DEET са чувствителни както към фармакологична блокада, така и към понижаване на M3 рецепторите, тествахме хипотезата, че DEET може да усили калциевата сигнализация. Изненадващо, DEET не успя да увеличи цитоплазмения калций в HUVEC (данните не са показани) и HEK/M3 (фиг. 4a, b) и за двете използвани концентрации.
Време на публикуване: 30 декември 2024 г.