Антихелминтното лекарство N,N-диетил-m-толуамид (ДИТ) се съобщава, че инхибира AChE (ацетилхолинестераза) и има потенциални канцерогенни свойства поради прекомерна васкуларизация. В тази статия ние показваме, че DEET специфично стимулира ендотелните клетки, които насърчават ангиогенезата, като по този начин увеличават туморния растеж. DEET активира клетъчните процеси, водещи до ангиогенеза, включително пролиферация, миграция и адхезия. Това е свързано с повишено производство на NO и експресия на VEGF в ендотелните клетки. Заглушаването на М3 или използването на фармакологични М3 инхибитори премахва всички тези ефекти, което предполага, че DEET-индуцираната ангиогенеза е М3-чувствителна. Експерименти, включващи калциево сигнализиране в ендотелни и HEK клетки, свръхекспресиращи М3 рецептори, както и изследвания на свързване и докинг, показват, че DEET действа като алостеричен модулатор на М3 рецепторите. Освен това, DEET инхибира AChE, като по този начин повишава бионаличността на ацетилхолина и неговото свързване с М3 рецепторите и засилва проангиогенните ефекти чрез алостерична регулация.
Първичните ЕК бяха изолирани от аортата на швейцарски мишки. Методът на екстракция е адаптиран от протокола на Кобаяши 26 . Миши ECs се култивират в EBM-2 среда, допълнена с 5% топлинно инактивиран FBS до четвъртия пасаж.
Ефектът от две концентрации на DEET върху пролиферацията на HUVEC, U87MG или BF16F10 беше анализиран с помощта на CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Накратко, 5.103 клетки на ямка се посяват в 96-ямкова плака, оставят се да се прикрепят за една нощ и след това се третират с DEET за 24 часа. След отстраняване на растежната среда, добавете разтвор за свързване на багрилото към всяка ямка на микроплаката и инкубирайте клетките при 37 °C за 30 минути. Нивата на флуоресценция се определят с помощта на многомодов четец на микроплаки Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия), оборудван с 485 nm възбуждащи филтри и 530 nm емисионни филтри.
HUVEC се посяват в 96-ямкови плаки при плътност от 104 клетки на ямка. Клетките се третират с DEET в продължение на 24 часа. Клетъчната жизнеспособност се оценява с помощта на колориметричен МТТ анализ (Sigma-Aldrich, M5655). Стойностите на оптичната плътност бяха получени на многомодов четец на микроплаки (Mithras LB940) при дължина на вълната 570 nm.
Ефектите на DEET са изследвани чрез in vitro анализи за ангиогенеза. Третирането с 10-8 М или 10-5 М DEET увеличава образуването на капилярна дължина в HUVECs (фиг. 1a, b, бели ленти). В сравнение с контролната група, лечението с концентрации на DEET, вариращи от 10-14 до 10-5 M, показва, че дължината на капиляра достига плато при 10-8 M DEET (допълнителна фигура S2). Не е открита значителна разлика в in vitro проангиогенния ефект на HUVECs, третирани с DEET в диапазона на концентрация от 10-8 М и 10-5 М.
За да определим ефекта на DEET върху неоваскуларизацията, ние проведохме in vivo проучвания за неоваскуларизация. След 14 дни, мишки, инжектирани с ендотелни клетки, предварително култивирани с 10-8 М или 10-5 М DEET, показват значително увеличение на съдържанието на хемоглобин (Фигура 1с, бели ленти).
Освен това, индуцираната от DEET неоваскуларизация е изследвана при U87MG носещи ксенотрансплант мишки, които са инжектирани ежедневно (ip) с DEET при доза, за която е известно, че индуцира плазмени концентрации от 10-5 М, което е нормално при експонирани хора. в 23. Откриваеми тумори (т.е. тумори >100 mm3) се наблюдават 14 дни след инжектиране на U87MG клетки в мишки. На 28-ия ден растежът на тумора е значително повишен при мишки, третирани с DEET, в сравнение с контролни мишки (Фигура 1d, квадрати). Освен това, CD31 оцветяването на тумори показва, че DEET значително увеличава капилярната площ, но не и плътността на микросъдовете. (фиг. 1e–g).
За да се определи ролята на мускариновите рецептори в DETA-индуцирана пролиферация, се използва 10-8 М или 10-5 М DETA в присъствието на pFHHSiD (10-7 М, селективен МЗ рецепторен антагонист). Лечение на HUVEC. pFHHSiD напълно блокира пролиферативните свойства на DETA при всички концентрации (Таблица 1).
При тези условия ние също проучихме дали DEET ще увеличи дължината на капилярите в HUVEC клетките. По същия начин, pFHHSiD значително предотвратява индуцираната от DEET капилярна дължина (фиг. 1a, b, сиви ленти). Освен това, подобни експерименти бяха проведени с M3 siRNA. Въпреки че контролната siRNA не е ефективна за насърчаване на образуването на капиляри, заглушаването на М3 мускариновия рецептор премахва способността на DEET да увеличава дължината на капилярите (Фиг. 1a, b, черни ленти).
Освен това, както 10-8 М, така и 10-5 М DEET-индуцирана васкуларизация in vitro и неоваскуларизация in vivo бяха напълно блокирани от pFHHSiD (фиг. 1c, d, кръгове). Тези резултати показват, че DEET насърчава ангиогенезата чрез път, чувствителен към селективни M3 рецепторни антагонисти или M3 siRNA.
AChE е молекулярната цел на DEET. Лекарства като донепезил, които действат като AChE инхибитори, могат да стимулират EC ангиогенезата in vitro и в модели на исхемия на задните крайници на мишки14. Тествахме ефекта на две концентрации на DEET върху AChE ензимната активност в HUVEC. Ниски (10-8 М) и високи (10-5 М) концентрации на DEET намаляват активността на ендотелната AChE в сравнение с контролните условия (Фигура 2).
И двете концентрации на DEET (10-8 М и 10-5 М) намаляват ацетилхолинестеразната активност върху HUVEC. BW284c51 (10-5 М) се използва като контрола за инхибитори на ацетилхолинестеразата. Резултатите са изразени като процент от активността на AChE върху HUVEC, третирани с двете концентрации на DEET, в сравнение с клетките, третирани с носител. Стойностите са изразени като средна стойност ± SEM от шест независими експеримента. *p <0,05 в сравнение с контролата (тест за множествено сравнение на Kruskal-Wallis и Dunn).
Азотният оксид (NO) участва в ангиогенния процес 33, следователно е проучено производството на NO в стимулирани от DEET HUVECs. Третираното с DEET ендотелно производство на NO беше повишено в сравнение с контролните клетки, но достигна значимост само при доза от 10-8 М (фиг. 3с). За определяне на молекулярните промени, контролиращи DEET-индуцираното производство на NO, експресията и активирането на eNOS бяха анализирани чрез Western blotting. Въпреки че лечението с DEET не променя експресията на eNOS, то значително повишава фосфорилирането на eNOS в неговото активиращо място (Ser-1177), като същевременно намалява неговото инхибиторно място (Thr-495) в сравнение с нетретираните клетки в eNOS фосфорилиране (Фиг. 3d). Освен това, съотношението на фосфорилираната eNOS в мястото на активиране и инхибиторното място се изчислява след нормализиране на количеството фосфорилиран eNOS към общото количество ензим. Това съотношение беше значително повишено в HUVECs, третирани с всяка концентрация на DEET в сравнение с нетретираните клетки (Фиг. 3d).
Накрая, експресията на VEGF, един от основните проангиогенни фактори, беше анализирана чрез Western blotting. DEET значително повишава експресията на VEGF, докато pFHHSiD напълно блокира тази експресия.
Тъй като ефектите на DEET са чувствителни както към фармакологична блокада, така и към понижаване на М3 рецепторите, тествахме хипотезата, че DEET може да подобри калциевото сигнализиране. Изненадващо, DEET не успя да увеличи цитоплазмения калций в HUVEC (данните не са показани) и HEK/M3 (Фиг. 4a, b) и за двете използвани концентрации.
Време на публикуване: 30 декември 2024 г