Пестицидите играят ключова роля в справянето с глобалния недостиг на храна и борбата с векторно пренасяните човешки заболявания. Нарастващият проблем с резистентността към пестициди обаче спешно изисква откриването на нови съединения, насочени към недостатъчно използвани цели. Каналите на потенциала на преходните рецептори при насекомите (TRPV) – Nanzhong (Nan) и неактивни (Iav) – могат да образуват хетероложни канали (Nan-Iav) и да се локализират в механосензорни органи, които медиират геотропизма, слуха и проприоцепцията при насекомите. Някои пестициди, като афидопиролидон (AP), са насочени към Nan-Iav чрез неизвестни механизми. AP е ефективен срещу пронизващо-смучещи насекоми (hemiptera), предотвратявайки храненето чрез нарушаване на функцията на нишките. AP може да се свързва само с Nan, но само Nan-Iav може да взаимодейства с агонисти, включително ендогенен никотинамид (NAM), като по този начин проявява канална активност. Въпреки потенциала на Nan-Iav като инсектицидна цел, малко се знае за неговото сглобяване на каналите, регулаторните места на свързване и Ca2+-зависимата регулация, което възпрепятства по-нататъшното разработване на инсектициди. В това проучване е използвана криоелектронна микроскопия за определяне на структурата на Nan-Iav в насекоми от рода Hemiptera в състояние без калмодулин-лиганд, както и с AP и NAM на границата на цитоплазмения домейн с анкиринови повторения (ARD). Изненадващо, открихме, че самият Nan протеин може да образува пентамер, който се стабилизира чрез AP-медиирани ARD взаимодействия. Това проучване разкрива молекулярни взаимодействия между инсектициди и агонисти и Nan-Iav, подчертавайки значението на ARD във функцията и сглобяването на каналите и изследвайки механизма на Ca2+ регулация.
На фона на все по-сериозните глобални климатични промени, влошаващата се продоволствена сигурност в световен мащаб е едно от основните предизвикателства на 21-ви век, с каскадни последици за обществото.1,2Докладът на Световната здравна организация „Състояние на продоволствената сигурност и храненето в света през 2023 г.“ (SOFI) изчислява, че приблизително 2,33 милиарда души по света страдат от умерена до тежка продоволствена несигурност, което е дългогодишен проблем.3,4За съжаление, приблизително 20% до 30% или повече от добивите на култури се губят годишно поради вредители и патогени, а глобалното затопляне се очаква да изостри устойчивостта на вредителите и уязвимостта на културите.4, 5, 6, 7, 8Разработването на пестициди е от решаващо значение не само за защитата на културите от вредители и намаляването на разпространението на векторно пренасяни патогени, но и за борбата с векторно пренасяни човешки заболявания като денга, малария и болест на Чагас, които са все по-устойчиви на пестициди.5, 9, 10, 11
Сред основните мишени на невротоксичните инсектициди, хетеротетрамерният TRPV канал Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) представлява клас инсектицидни мишени, открити едва през последното десетилетие, включително търговски достъпни инсектициди като имидаклоприд и пираклостробин.12, 13, 14Полусинтетичният инсектицид афидопиролифен (AP) е наскоро разработен и комерсиализиран продукт, чийто основен компонент е активният инсектицид Inscalis®, който се свързва с AP на субнаномоларно ниво на активност.15AP проявява ниска остра токсичност към опрашители, полезни насекоми и други нецелеви организми и когато се използва съгласно инструкциите на етикета, може да намали резистентността към други инсектициди.16, 17, 18Nan и Iav са широко разпространени сред видовете насекоми, коекспресират се само в невроните на хордалните рецептори за разтягане на антените и крайниците и са критични за слуха, възприятието на гравитацията и проприоцепцията.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, имидаклоприд и пираклостробин стимулират Nan-Iav комплекса чрез уникален механизъм, като в крайна сметка инхибират проприоцептивната сигнална трансдукция.13, 16, 23При пронизващо-смучещите насекоми (hemiptera), като листни въшки и белокрилки, загубата на проприоцепция нарушава способността им за хранене, което в крайна сметка води до смърт.13,24Интересно е, че AP проявява висок афинитет към Nan-Iav комплекса и нисък афинитет към Nan самостоятелно. Свързването на AP с Nan-Iav индуцира електрически ток, но свързването само с Nan не стимулира активността на канала. Самият Iav изобщо не се свързва с AP.16Това предполага, че Nan и Iav могат да се свързват, за да образуват различни Nan-Iav канални комплекси (напр. с различни стехиометрични съотношения или различни подредби в рамките на едно и също стехиометрично съотношение) или че AP може да се свързва с множество места. Освен това, естественият агонист никотинамид (NAM) се свързва с Drosophila Nan-Iav с микромоларен афинитет, проявявайки ефекти, подобни на тези на листните въшки (AP) in vitro.16,25и потискане на размножаването и храненето на листните въшки, което в крайна сметка води до тяхната смърт25,26Тези данни повдигат много въпроси. Например, остава неясно как се образува хетеродимерът Nan-Iav, кои места на свързване се използват за модулиране на малки молекули и как тези малки молекули регулират функцията на каналите чрез потискане на проприоцепцията. Освен това, причините, поради които самият Nan е неактивен и има нисък афинитет към AP, докато хетеродимерът Nan-Iav е активен и се свързва с AP с по-висок афинитет, остават неясни. И накрая, малко се знае за Ca2+-зависимата регулация на функцията на Nan-Iav и как тя е интегрирана в невронните сигнални процеси.13,21
В това проучване, комбинирайки криоелектронна микроскопия, електрофизиология и техники за свързване на радиолиганди, ние изяснихме сглобяването на Nan-Iav и механизма на неговото свързване с регулатори с малки молекули. Освен това, открихме конститутивно свързан калмодулин (CaM) към Iav и AP-стабилизирани Nan пентамери. Тези резултати предоставят важна информация за регулирането на калциевите йони в каналите, сглобяването на каналите и факторите, определящи афинитета на свързване на лиганда. По-важното е, че потвърдихме, че ARD играе централна роля в тези процеси. Нашето проучване на пълни канали на насекоми, свързани със съответните селскостопански пестициди.27, 28, 29отваря перспективи за развитието на пестицидната индустрия, подобрявайки ефикасността и специфичността на пестицидите и позволявайки прилагането на TRPV-насочени съединения към други видове, за да се справи с глобалната продоволствена сигурност и разпространението на векторно пренасяни болести.
Установихме също, че Nan-Iav се регулира от Ca2+, а механизмът на регулиране се медиира от конститутивно свързан CaM. Важно е да се отбележи, че тази Ca2+-зависима регулация на Nav от CaM се различава значително от механизмите на регулиране на други йонни канали (напр. волтажно-зависими Na+ канали и TRPV5/6 канали).52, 53, 54, 55, 56, 57В Nav1.2 канала, C-терминалният домейн на CaM се свързва спирално с C-терминалния домейн (CTD), а Ca2+ индуцира свързването на неговия N-терминален домейн с дисталната част на CTD.56В TRPV5/6 канала, C-терминалният домейн на CaM се свързва с CTH, а Ca2+ индуцира удължаване нагоре на N-терминалния си домейн в пората, като по този начин блокира пропускливостта на катионите.53,54Предлагаме модел за Ca2+-регулираната функция на Nan-Iav-CaM (фиг. 4h). В този модел, N-терминалният домейн на CaM конститутивно се свързва с C-терминалния домейн (CTH) на Iav. В състояние на покой (ниска концентрация на [Ca2+]), C-терминалният домейн на CaM взаимодейства с Nan, стабилизирайки ARD конформацията и по този начин насърчавайки отварянето на канала. Свързването на агонист/инсектицид с канала индуцира отваряне на порите, което води до приток на Ca2+. След това Ca2+ се свързва с CaM, причинявайки дисоциация на C-терминалния домейн от ARD на Nan. Тъй като блокирането на CaM свързването по същество премахва инхибиторния ефект на Ca2+, тази дисоциация модулира ARD мобилността, като по този начин причинява Ca2+-зависимо инхибиране или десенсибилизация. Бързото възстановяване на каналните токове след елуиране на калциеви йони (фиг. 4g) предполага, че този механизъм улеснява бързите реакции на Ca2+-медиирани невронни сигнали. Освен това, C-терминалният регион на Iav, който все още е слабо проучен, е съобщен, че играе други роли в насочването на каналите и регулирането на тока.21
Накрая, нашето проучване представя структурата с висока резолюция на инсектицидно-инсектициден TRP канален комплекс със селскостопанско значение – откритие, непознато досега за нас. Забележително е, че ние характеризирахме структурата и функцията на насекомния канал в човешки клетки (HEK293S GnTi–), а не в насекомни клетки. В условията на нарастваща резистентност към инсектициди и продължаващ натиск върху продоволствената сигурност и патогените, нашата работа предоставя важна информация, която ще улесни разработването на нови инсектициди в полза на човешкото здраве и глобалната продоволствена сигурност. Проучванията показват, че инсектициди като AP са ефективни срещу някои вредители, когато се използват съгласно инструкциите на етикета, и имат ниска остра токсичност за полезните опрашители, което демонстрира тяхната безопасност за околната среда.13,16Освен това, тестването на някои AP производни върху комари показа, че те в крайна сметка губят способността си да летят. Разбирането на това как тези модулиращи съединения се свързват с Nan-Iav ще улесни модифицирането на съществуващите съединения или разработването на нови съединения за по-ефективно и...прецизенконтрол на вредителите. Нашето проучване показва, че Nan-Iav ARD интерфейсът е критичен не само за регулиране на активността на ендогенни съединения, пестициди и Ca2+-CaM, но и за сглобяването на каналите. Предполагаме, че разрушаването на сглобяването на хетеродимери с малки молекули може да бъде уникален и обещаващ подход за разработване на инхибитори на йонните канали.
От осемте ортологични гена бяха избрани пълнометражните гени на кафявия бръмбар (Halyomorpha halys) Nanchung и Inactive, показващи отлична стабилност в детергенти. Синтезираните гени бяха оптимизирани по кодон за човешка експресия и клонирани във вектора pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies), използвайки рестрикционни сайтове XhoI и EcoRI. Това гарантира, че клонингите са в рамка с C-терминалните GFP-FLAG-10xHis и mCherry-FLAG-10xHis тагове, които се разцепват от HRC-3C протеаза (PPX), което позволява независимо...изразПраймерите, използвани за клониране на Nanchung и Inactive във вектора pBacMam, са следните:
Микроскопски изображения на отделни частици са получени на трансмисионен електронен микроскоп Titan Krios G2 (FEI), оборудван с K3 камера и енергиен филтър Gatan BioQuantum. Микроскопът е работил при 300 keV, с енергийна настройка 20 eV, размер на пиксела на пробата 1,08 Å/пиксел (номинално увеличение 81 000x) и градиент на дефокусиране в диапазона от -0,8 до -2,2 μm. Видеозаписът е извършен при 40 кадъра в секунда с помощта на микроскоп Latitude S (Gatan) с номинална мощност на дозата 25 e–px−1 s−1, време на експозиция 2,4 s и обща доза приблизително 60 e–Å−2.
Корекция на движението, индуцирано от лъча, и дозово претегляне бяха извършени върху филм, използвайки MotionCor2 в RELION 4.061. Оценката на параметъра на функцията за трансфер на контраст (CTF) беше извършена в cryoSPARC, използвайки метода за оценка на CTF, базиран на patch-базиран 62. Фотомикрографии с CTF резолюция ≥4 Å бяха изключени от последващия анализ. Обикновено, подмножество от 500–1000 фотомикрографии беше използвано за селекция на точки в cryoSPARC, последвано от няколко кръга на 2D класификация след филтриране, за да се получи ясно референтно изображение за селекция на частици, базирана на шаблон. След това частиците бяха извлечени, използвайки 64-пикселови ограничаващи кутии и 4-кратно бининг. Бяха извършени няколко кръга на 2D класификация, за да се премахнат нежеланите категории частици. Първоначалният 3D модел беше реконструиран, използвайки ab initio реконструкция, и прецизиран, използвайки неравномерно прецизиране в cryoSPARC. 3D класификацията беше извършена в cryoSPARC или RELION въз основа на хетерогенност на ARD. Не беше наблюдавана значителна хетерогенност на мембранните домейни. Частиците бяха прецизирани, използвайки методите C1 и C2; Частиците с по-висока C2 резолюция бяха считани за симетрични спрямо C2 и импортирани в RELION за байесово прецизиране. След това частиците бяха прехвърлени обратно в cryoSPARC за окончателно неравномерно и локално прецизиране. Крайната резолюция и броят на частиците са показани в Таблица 1.
При обработката на Nan+AP пентамери, ние проучихме различни методи за подобряване на разделителната способност на мембранните домени (особено на порестата област), като например изваждане на сигнала и TMD маскиране. Тези опити обаче бяха неуспешни поради потенциално екстремното разстройство в порестата област и общата хетерогенност на TMD. Крайната разделителна способност беше изчислена с помощта на маска, генерирана автоматично от метода за нееднородна обработка в cryoSPARC, насочен предимно към ARD областта. Това постигна значително по-висока разделителна способност от тази на мембранните домени (особено VSLD областта).
Първоначалните de novo модели на апо формите на бактерията Nanchung и Inactive бяха генерирани първоначално с помощта на Coot63, а моделите на бактерията Nan и Iav бяха генерирани с помощта на AlphaFold264 за идентифициране на региони с ниска достоверност. Моделирането на калмодулин се основаваше на твърдотелни съпоставяния на моделите за свързване и свободни от Ca2+ в PDB регистри 4JPZ56 и 1CFD65, съответно. Моделите бяха усъвършенствани с помощта на сферично усъвършенстване, за да се осигури правилната стереохимия и добра геометрия. Фосфатидилхолинът, фосфатидилетаноламинът и фосфатидилсеринът след това бяха моделирани като добре дефинирани липидни плътности, а NAM и AP лигандите бяха поставени в съответните плътности в плътните връзки. Файловете с ограничения бяха генерирани от SMILES низа на изоформите, използвайки eLBOW в PHENIX66. Накрая моделите бяха усъвършенствани в реално пространство в PHENIX, използвайки локално търсене в мрежата и глобално минимизиране с ограничения на вторичната структура. За усъвършенстване на модела и структурен анализ е използван сървърът MolProbity, а илюстрациите са извършени с помощта на PyMOL и UCSF Chimera X. 67,68,69 Анализът на апертурата е извършен с помощта на сървъра HOLE,70 а картографирането за запазване на последователността е извършено с помощта на сървъра Consurf.71
Статистическият анализ е извършен с помощта на Igor Pro 6.2, Excel Office 365 и GraphPad Prism 7.0. Всички количествени данни са представени като средна стойност ± стандартна грешка (SEM). За сравняване на две групи е използван t-тест на Стюдънт (двустранен, несдвоен). За сравняване на множество групи е използван еднофакторен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post hoc тест на Дънет. *P< 0,05, **P< 0,01 и ***P< 0,001 се считат за статистически значими в зависимост от разпределението на данните. Стойностите на Kd, Ki и техните асиметрични 95% доверителни интервали са изчислени с помощта на GraphPad Prism 10.
За повече подробности относно методологията на изследването, моля, вижте резюмето на доклада за портфолиото на природата, чийто линк е посочен в тази статия.
Първоначалният модел е изграден с помощта на калмодулинови модели от базите данни PDB 4JPZ и 1CFD. Координатите са депозирани в банката данни за протеини (PDB) под номера за достъп 9NVN (Nan-Iav-CaM без лиганд), 9NVO (Nan-Iav-CaM, свързан с никотинамид), 9NVP (Nan-Iav-CaM, свързан с никотинамид и EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM, свързан с афенидолпиролин и калций), 9NVR (Nan-Iav-CaM, свързан с афенидолпиролин и EDTA) и 9NVS (Nan пентамер, свързан с афенидолпиролин). Съответните крио-електронно-микроскопски изображения са депозирани в базата данни за електронна микроскопия (EMDB) под следните номера за достъп: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM без лиганд), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM комплекс с никотинамид), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM комплекс с никотинамид и EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM комплекс с афидопиролин и калций), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM комплекс с афидопиролин и EDTA) и EMD-49849 (Nan пентамерен комплекс с афидопиролин). Суровите данни за функционалния анализ са представени в тази статия.
Време на публикуване: 28 януари 2026 г.